PCR的完整 *** 作步骤是什么？

首先在PCR仪中设定程序：一般是94度变性5min，之后“94度变性、退火（不同引物温度不同）、72度”延伸共30-35个循环，再72度延伸10min，最后hold16度即可。反应体系一般有20微升或50微升，由上下游引物、buffer、dNTP、模板、Taq酶和水等组成，配好后放入PCR仪中按设定程序进行即可。

PCR即聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction）的缩写，它是体外酶促合成特异DNA片段的方法。这一方法的要点是合成两个分别互补于待扩增DNA片段两端的小片段引物，在含有引物、待扩增DNA模板核苷酸底物和DNA多聚酶的反应体系中DNA复制反复进行，在短时间内可以取得大量扩增产物。其原理是寡聚核苷酸链引物在DNA聚合酶的作用下沿模板延伸，合成两个与靶DNA两侧序列互补的引物，在体外进行靶DNA的重复合成。

主要的技术步骤是：

（1）DNA变性 加热使靶DNA序列双链解离成单链DNA。

（2）引物与靶DNA退火 适当降低温度，使两个引物分别结合成靶DNA两条的3′末端向5′末端延伸。

（3）引物延伸 在DNA聚合酶的催化下，引物沿着靶DNA3′末端向5′末端延伸。新合成的DNA链在变性解离后，又可作为模板与引物杂交，并且在DNA聚合酶的催化下，引导合成新的靶DNA链。如此反复进行以上3个步骤，即可使靶DNA片段指数性扩增。

Touch down(TD)PCR是一种特殊技术。采用它我们可以不需做预实验来进行条件选择，只需要做一次正式实验，就可能保证此次扩增试验在即使不是最佳也是在比较理想的条件下进行的，绝大多数情况下都可以获得理想的扩增效果。

其基本 *** 作是：根据对引物Tm值的计算，确定一个退火温度的大范围（不是一个点，而是一个可以跨越10～20度的范围），计算的Tm值应落在这个范围中间。在做扩增周期程序设定时，让退火温度从选定范围的最高温度开始逐步降低温度，每次降低一度，最后结束在选定范围的最低温度处。在每一个停留温度上循环两次。这样，引物在某一较高温度下与模板复性并引发延伸合成产物，通常是特异性扩增产物，因为它是在最早也即Tm值较高的条件下引发合成的，在随后退火温度继续下降的过程中，上述的延伸合成会继续进行。可以想象，在退火温度下降过程中，很有可能引物还会在模板上找到第二个复性并引发延伸的部位，但是由于该位点是在更低的Tm值下与引物复性的，故通常是“假阳性扩增”。这两个产物在含量上有极大区别。如果特异性扩增带与假阳性带之间的Tm值相差3度，由于在每个温度上进行两次循环，故特异性较高的合成产物经过了6次循环后假阳性产物才开始合成，故特异性产物的量大于假阳性产物的64倍（26），两者在量上是不难区别的。

touch down pcr就是降落pcr，可以选定一个温度范围，如50——35，每个温度2循环，然后在50度15循环。其原理是，随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。这种方法的退火温度范围较大，在不知道最佳退火温度时比较适用。

降落PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性，循环在比估算的Tm高大约5度的退火温度下开始，然后每循环降低1度到2度，直到退火温度低于Tm5度。只有同源性高的目的摸板会被继续扩增 ，这些产物在随后的循环中继续扩增，并会将扩增的非特异性产物排挤出去。降落PCR对于那些不了解引物和目的摸板同源性程度的方法较为有用，如AFLP DNA指纹分析。

这是标准的touchdown PCR

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