什么是realtime PCR，什么是q-pcr，所用反应物质与普通PCR有何不同

实时定量PCR (real-time quantitative PCR),简称real-time PCR，q-pcr，q-RT-PCR等等，都是一个意思。普通PCR结果反映的其实是PCR的结果，而当PCR经过多伦循环到平台期后，很难反映原来模板的浓度；而实时定量亩孙PCR 反映的是PCR的过程，它起飞时间的Ct值可以精确反映模板的浓度。定义， *** 作，原理什么的我就不说了，自己查百度百科和文库，我就从实战给你点注意事项吧。

1 选好内参基因，特别是同一物种不同组织中某基因的表达情况，一定要别人报道过在你检测的组吵耐首织中变化不大，如果你只是拿一个别的物种中的同源基因，别人肯定会argue你的，如果有可能可以双内参。

2 最好有标准曲线，标曲反应扩增效率，这样比较准确点，不然只能用2 delta delta t法了，有些杂志扣的话，不太好解释。标曲可以用cDNA来制备，还可以直接有已知模板来制（可以搜一下网上的标曲制备方法）

3 结升数果先看融解曲线，如果只有特异的单一融解峰，再去分析数据，不然没有意义。

qPCR这项技术，被广泛用于生物学的研究，只有有以下用途：

qPCR作为一种DNA定量手段，一般情况下， 还可以分为 绝对定量 和 相对定量 。

好的， 那么一般情况下， 我见过比较多的qPCR，都是以RNA相对定量为目的的，也是本文讨论的焦点。

qPCR和PCR一看名字就知道很像， q 就是quantitative的意思，quantitative就是定量的意思。。。（为我的废话鼓掌）

其实，说到底，qPCR就是通过荧光染料或者荧光探针来表征PCR产物的量，进而推断出PCR前，样本的初始核酸量。

具体原理是，对于不同的样本和基因，比较到达一定荧光强度所需要的循环数， 如果你的样本中DNA1的量 大于 DNA2的量，那么理论上， DNA1比DNA2需要更少次数的PCR扩增就可以达到某一个阈值.

如果对于详细原理有什么执念的同学可以自行百度，必应，谷歌。。。

在实际实验过程中， 我们的实验没那么简单

一个仿真例子：

那么我们一般这样做，我会有处理和未处理的细胞，我们想比较这两种细胞geneA表达量的差异，我们在提取细胞的RNA并定量后反转成cDNA后，进行qPCR， 获得geneA和某一个内参基因（如GAPDH）的CT值。内参基因GAPDH在这里起到一个矫正的效果来去除不同的样品间 RNA产量 ， RNA质量 以及 逆转录效率 上的差别。

最最最常用的qPCR相对定量的方法是 ΔΔCT 法 （读作：delta delta CT）

公式如下

即 先用内参基因校准，再算样品与对照组间的差异 ，而我们的表达量的差异就可以表征为

虽然大多数qPCR设备都配有很完备的分析软件，

但是 。。。。。

这些软件的图可能不适合直接放文章，或者， 咳咳，很丑,你想自己修改之类的

而他们一般都不太提供最终计算结果，只提供CT值，那么这个就很让人头大了。

于是乎

秉承着 自己动手丰衣足食 一直折腾一直爽 的传统美德，我写了一个小小的工具，方便大家计算最终的相对表达量

该工具基于微软爸爸的EXCEL和VBA，不限样本数量，基因数量及每组实验的平行个数（如果你有三个复孔，其中一个如果敬拦CT和其他两个差别很大凯稿山，你可以删除该孔，有些组3个复孔，有些2个，不影响程序运行）

在同学（zi）的（ji）强（xian）烈（de）要（mei）求（shi）下，我的qPCR数据处理小程序迎来了V2.0版本，主要增加了自动添加误差线的功能。

大家感受一下， 一键出图 的魅力，喜欢的同学记得点赞，转发哦, 获取链接在文末

获得相对表达量值之后呢，你可以使用origin或者graphpad等工具作图，读者可以查看我往期关于origin的文章哦

文章直通车>>> origin科研作图

此工具如有任何问题或者你们有什么盯中建议或者链接失效等情况，请于同名微信公众号留言

1概念

RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。

逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。

由一条RNA单链转录为互补 DNA (cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的 DNA聚合酶 （逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。

RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。）

RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。

时实PCR，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量仔销禅分析。

real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。一种是在ds DNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。

real time PCR 与 reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”

2 PCR各步骤的目的

2.1预变性：

破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。 使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响斗尘，以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。

2.2 变性--退火--延伸循环：

2.2.1模板DNA的变性 ：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

2.2.2模板DNA与引物的退火(复性) ：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

2.2.3引物的延伸 ：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成念尘一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

3用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因 ：

3.1. 延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。（当然是在反应体系一定的条件下）例如，使用taqDNA聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s，因此延伸速率为1kb/min。

3.2. 根据延伸速率推得，扩增1kb以内的dna片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min，依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min，这样做是使pcr反应完全以提高扩增产量。

3.3. 继续72度延伸了10分钟除了可以使pcr反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。

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