ITS序列分析的应用原理和主要步骤有哪些

我正好也在做这个诶~

原理：rDNA中18S、5.8S与26S的基因序唤空列在真核生物中高度保守,而ITS承受的选择压力较小,相对进化速度较快,具有很高的可变性,且在核基因组中高度重复,这样可以根据保守序列中的变异位点设计特殊引物对ITS区冲晌进行PCR扩增。ITS区的可变性为物种鉴定提供了丰富的变异位点和信息位点,对ITS区进行PCR扩增、测序及序列分析后再设计特异和判瞎引物,来诊断和检测植物病原菌以及植物类群等,已得到越来越广泛的应用。通过ITS序列的分析，还可以判断很多属、种之间的亲缘关系。

主要步骤：首先是提取基因组DNA，然后通过引物扩增ITS序列，对于效果好的进行测序，测得的序列在用软件进行分析

在大多数情况下，是先培养植物的内生真菌，然后再提取真菌DNA，进行PCR扩增ITS序列。一般不建议直接提取植物和真菌混合物的总DNA。

大致过程是：

1、将植物用无菌水洗净，根据植物的状橡伍凯态与特点，用乙醇 / 次氯酸钠 / 升汞 进行处理一般为5-10分钟。然梁唤后用无菌水清洗，反复几次。

乙醇 / 次氯酸钠 / 升汞 这三种消毒剂的杀菌性也就是毒性越来越强，虽然升汞的消毒效果最好，但是对于植物本身和内生真菌的破坏性也会加大，所以可以根据不同的情况，选择合适的试橘森剂，进行消毒，这里主要是除掉植物表面的微生物。

如果为了尽量保护内生菌，可以用75%乙醇与无菌水，反复交替处理5-10次，对于一些不易被破坏的组织，如纤维化组织，木本材料，种子等，可以用 次氯酸钠 或 升汞 与无菌水交替处理3次。

2、将消毒后的植物样本，在无菌条件下，切割成合适大小，放到广谱的真菌培养基（琼脂板）上培养，按照实验需要，选择合适的培养温度和培养时间，然后观察从植物内部产生的真菌菌落或菌丝，然后挑取接种至液体培养基，扩大培养。

3、将真菌培养物收集，提取DNA。

建议用试剂盒

4、PCR扩增。

由于有些ITS序列的特殊性，需要加大循环数，并且进行退火温度的优化。根据本人以及一些同行的经验，可以用梯度PCR仪选择较大范围的退火温度，在35-40个循环条件下开始进行优化。

当电泳出现扩增片段后，然后再确定退火温度并减少循环数。对于部分真菌ITS，循环数一定要超过30，这个需要实验人员自行优化。

---