怎样用单片机控制音响的音量

单片敬颤物机控制音响的音量的方式有两种：

一种是控制音响音量的采用马达电位器，单片机控制马达顺时针或逆时针转动，实现音量控制。和传统的电位器相比相当于在普通电位器基础上增加了马达实现音量控制，这类电位器的尺寸比洞老较大，而且因为马达经常转动，故障率相对较高。

还有种是采用集成电路来实现：亮液用专用的音量控制集成电路加上编码开关（也叫数字电位器）配合单片机程序实现对音量控制。例如PTC（台湾普城 http://www.princeton.com.tw）品牌的PT2313等，和马达控制相比较有可靠性高，体积小的优点。

首先要明确虚拟CD的位置，也就是要把虚拟CD的rip格式从ieq调出来，从硬盘显示，只有显示了才可以读出来。把MP3格式的东西复制或刻录到虚拟CD位置的根文件夹就可以读出了。

1、高音、响度、右声道平衡、输入增益（每个通道都独立）控制在切换到AUX状态时候，显示屏显示PHONE而不AUX，这个改不了有独立小液晶屏颂闭显示工作状态，全中文，直观明了所有设置都不会丢失，关机再开机会自动回到上次关机时状态。

2、独立AUX输入，可选择哪个输入信号1个混合AUX输入，不可选择，用来接电脑啊导航之类，声音AUX输入同时出声音功能：控制了一个无损播放器上一首、下一首、音量+-、播放目录切换，播放暂停接管了原车蓝牙电话，在实现以上功能同时，余樱亮不影响蓝牙电话使用。

3、增加PT2314 4立体声输竖宽入，2立体声输出带音量、平衡、立体声声道输入切换以及响度功能音频处理器，输出接蓝牙电话（车载蓝牙电话相信没有几个人会用上吧）音频输入端或者CD音频输入端，通过单片机编写I2C驱动程序切换到蓝牙电话、并且切换输入音源，采用红外线控制，这样不但可以控制音源还能简单调节音质响度等功能。

目前，移植排斥反应仍然是制约肝移植疗效的主要原因。虽然由于免疫抑制剂的临床应用，肝移植的1年的存活率大幅度提高，已超过了80%。但是终生服用免疫抑制剂不仅成为患者沉重的经济负担，而且造成机体的免疫功能低下，可能促进肝炎及肿瘤复发，诱发感染、肿瘤等疾病。因此，找寻诱导特异性移植耐受的新方法，是克服移植排斥反应的最佳途径。

特异性移植耐受是指在无需使用免疫抑制药物的情况下，受者的免疫系统对同种异体或异种供体抗原长期不发生免疫反应，而对其它抗原可发生正常免疫应答的状态。目前认为，诱导机体产生免疫耐受涉及免疫清除、免疫失能、免疫抑制和免疫忽视四类机制[1]。根据以上诱导免疫耐受的机制，学者们发展出许多诱导移植耐受的新方法[2]：(1)在胸腺内直接注射表达供体抗原的细胞，在胸腺内通过克隆清除诱导免疫耐受。(2)利用骨髓移植造成造血细胞嵌合体诱导耐受。迅锋(3)阻断T细胞活化的共刺激信号通路。(4)输注供体树突状细胞(Dentritic cell，DC)诱导耐受。(5)针对T细胞粘附和活化相关分子的单克隆抗体：抗T细胞及T细胞亚群的单抗；抗粘附分子或细胞因子的单抗。(6)其它特异性免疫抑制的方法：合成肽阻断TCR对同种异体抗原的识别；合成肽阻断趋化因子及其受体。以上方法均不亩逗晌同程度地诱导了对供体抗原的耐受，但它们存在如下不足：(1)成年人胸腺已经萎缩，无法在胸腺内直接注射表达供体抗原的细胞，故该方法适用范围大大受限。(2)供体骨髓移植能诱导部分耐受，但不易控制嵌合程度，移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)的发生率大大增加。(3)DC诱导的淋巴细胞失能状态可通过给予外源性IL-2而逆转；感染或其它因素引起机体强烈的免疫应答，产生大量的IL-2等细胞因子也可以通过旁效应解除失能的细胞克隆；失能状态的维持需要抗原的持续存在，抗原的去除也能逆转失能。(4)阻断协同刺激通路、应用针对T细胞粘附和活化相关分子的单克隆抗体、合成肽阻断TCR对同种异体抗原的识别、阻断趋化因子及其受体等方法能诱导出确切的免疫抑制，但是其作用范围是全身性的、非特异性的，且一旦中止阻断剂的供给，则移植耐受消失。总之，目前诱导移植耐受的方法存在非特异性、容易逆转、实际 *** 作困难等缺陷。

肝移植排斥反应启动时，首先表现为淋巴细胞对汇管区中央静脉周围的浸润，随着排斥反应的进展，淋巴细胞的损伤导致小叶间胆管上皮细胞、中央静脉内皮细胞的炎症，最后指世波及汇管区周围的肝实质细胞，造成广泛的肝脏炎性反应。因此肝移植排斥反应的过程是从汇管区启动，进而扩展至小叶间胆管上皮细胞、中央静脉内皮细胞、汇管区周围的肝实质细胞。移植排斥反应发生时，CTL细胞在活化后可以通过以下两条途径杀伤靶细胞：(1)穿孔素/颗粒酶途径。(2)Fas/FasL途径：在CTL细胞识别靶细胞后，细胞表面表达的高水平FasL与靶细胞表面的Fas相互识别，通过Fas触发靶细胞内部的凋亡程序，使靶细胞发生程序性死亡。体外实验证实两条途径相互独立。然而体内实验证实单一阻断Fas/FasL途径即可抑制CTL对靶细胞的杀伤，其原因可能与体内环境有关28.

诱骗受体3(Decoy receptor 3，DcR3)是一种新发现的可结合FasL的可溶性TNFR超家庭成员，RNA印迹表明DcR3 mRNA 表达于胎肺、脑、肝及成人脾、结肠和肺，特别是在肺癌和结肠癌细胞系的表达很高，也可由T细胞丝裂原激活的外周血单核细胞分泌。DcR3 分子质量为35kDa，肽链长300个氨基酸残基。DcR3 的配体是LIGHT、FasL、TL1A。其主要作用有：(1)与Fas竞争性结合FasL，阻断FasL所诱导的细胞凋亡，这一作用可以减弱CTL和NK细胞对靶细胞的杀伤[14]。(2)通过抑制LIGHT与HveA 或TR2之间的双向信号转导、TL1A至DcR3的单向信号转导来抑制T细胞激活。7 (3)抑制CXCL12/基质细胞来源的因子1α(SDF-1α) 、FasL对T细胞的趋化作用，从而减少CD4+和CD8+T细胞对肿瘤的浸润。25. 27．(4)通过调节DC分化和成熟从而抑制CD4+ T细胞增生。20．(5)抑制T细胞伪足形成，阻止它们形成不可分离的细胞簇从而调节T细胞与其它细胞如APC的相互作用。7

因此根据其作用机理，人们推测其可能有以下四方面的作用(1)肿瘤细胞逃避免疫监视。（2）抗炎作用。(3)致癌作用。（4）诱导移植耐受。目前的研究工作已经肯定DcR3基因对肿瘤细胞逃避免疫监视、抑制炎症反应的作用，但DcR3基因的高表达与细胞癌变无相关性，不是癌基因。Wu等证实DcR3减少了FasL、IFN-γ诱导的胰岛细胞凋亡及胰岛素释放，可防止同种异基因胰岛移植时的胰岛原发性无功能。2Zhang等于心脏移植术前一天开始连续7天静脉注射DcR3，小鼠心脏存活时间比对照组延长3.3天，提示DcR3可以减弱T细胞对同种异体抗原的反应。24我们利用腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)（AAV Helper－Free System, Stratagene 公司）作为DcR3基因的载体，将AAV病毒颗粒从门静脉、肝动脉、胆管注入冷保存时的供肝，成功实现了DcR3基因在供肝的表达，在没有使用免疫抑制剂的情况下，供肝正常存活了105天（目前仍然存活，继续观察中），而对照组仅存活了15天（见研究工作基础）。AAV Helper－Free System的特点有：病毒载体产生、效价滴定阶段均不需野生型腺病毒共感染，因此有极高的生物安全性、宿主的免疫反应极小；AAV可感染的细胞类型广泛，感染不依赖于活跃的细胞分裂；AAV病毒滴度高，常规可达107病毒颗粒/ml，经浓缩可达1012病毒颗粒/ml；AAV在允许复制的条件下可在染色体外复制，在不能复制的条件下可以5-10%的效率定点整合入宿主19号染色体的一个2-4kb的区域，因此AAV被证明有应用于基因长期表达的价值。我们目前的研究工作的特色有：（1）证明了腺相关病毒携带的DcR3基因可以诱导肝移植耐受。(2)采用AAV Helper－Free System克服了逆转录病毒载体转导效率低、随机整合入受者染色体中而致肿瘤的危险的缺点[1]以及腺病毒载体虽然有较高的转导率,但因不能在染色体外复制或整合入受者染色体中,目的基因只能一过性表达的缺点[2]。我们目前研究工作的缺陷有：（1）DcR3基因仅在肝脏血管内皮细胞、胆管上皮细胞表达，而急性排斥反应启动时CTL细胞首先浸润的是汇管区的中央静脉周围，因此它尚不能阻止急性排斥反应的启动，仅能阻止CTL细胞血管内皮细胞、胆管上皮细胞的攻击。（2）DcR3基因转染的血管内皮细胞、胆管上皮细胞是成熟的细胞。虽然携带DcR3基因的AAV可在染色体外复制或整合入宿主基因组而使DcR3基因存在长期表达的可能，但是成熟细胞存在新老交替，DcR3基因的表达随着细胞的死亡而消失。因此为了完善我们目前的研究工作，我们需要作以下的改进：（1）将DcR3基因的表达定位于汇管区中央静脉周围，抑制排斥反应的启动。如能进一步将DcR3基因表达于血管内皮细胞、胆管上皮细胞、肝细胞，则更能防止个别活化的CTL细胞对它们的攻击，从而形成抑制排斥反应的“双保险”。（2）实现DcR3基因的持续表达。

肝干细胞（Hepatic Stem Cell，HSC）是指具有自我更新能力和具有分化形成肝细胞与胆管细胞潜能的原始细胞。最近有人证实它尚可分化为血管内皮细胞(Gao Z, McAlister VC, Williams GM. Repopulation of liver endothelium by bone-marrow-derived cells. Lancet. 2001 Mar 24357(9260):932-3.) [11]。肝干细胞的基本特征可概括为两点：①具有多向分化能力，可向肝细胞、胆管上皮细胞、肝脏血管内皮细胞分化。②具有自我更新与自我维持能力，对肝脏损伤或疾病产生反应并进行修复。其形态特点是细胞体积小、核大而胞质少、呈卵圆形、具有特殊的表面标志如AFP、肝细胞标志（白蛋白）、胆管上皮细胞标志（CK7、CK19）以及肝细胞、胆管上皮细胞共有的标志(CK8、CK18)。目前有人证实其尚有血管内皮细胞的标志。

该类细胞不仅在胚胎肝组织中存在，而且在成年肝组织中也存在。肝内的肝干细胞称为卵圆细胞(Hepatic Oval Cell，HOC)或小肝细胞。它们在正常情况下位于肝脏汇管区的Hering小管[D]，当肝脏受到损伤（肝毒性药物、手术、创伤、缺血再灌注等）时，它们迅速增生分化，补充受损的肝细胞、胆管上皮细胞、肝脏血管内皮细胞分化，因而被称为肝干细胞池[A]。目前大量文献证实，肝脏损伤时，肝脏有三个水平的细胞修复：肝细胞、Hering 小管的双向干细胞、Hering小管周围的来自骨髓的肝干细胞。骨髓来源的干细胞可定居于Hering小管周围，在肝脏损伤时发挥修复作用[K]。Theise ND等通过三维观测得出Hering 小管、汇管区周围是肝干细胞存在的场所的结论[G]。Petersen 证实肝内存在骨髓来源的干细胞，Theise 大鼠2%，人4-40%。Alison0.5-2%(hsc8,78,79)。Lagasse 30%.认为Hering管可能是人肝干细胞起源分化及滞留场所(TheiseND,SaxenaR,PortmannBC,etal.Thecanalsofheringandhepaticstemcellsinhumans[J].Hepa-tology,1999,30:1425-1433.)

肝干细胞的肝外来源包括胰腺的上皮细胞、胰岛前体细胞、骨髓造血干细胞[3,4]。自1999年Petersen等发现肝卵圆细胞可来源于骨髓后,从骨髓细胞中鉴定肝干细胞成为近年研究的热点。目前研究证实从骨髓中分离纯化的造血干细胞的多个亚群在一定的微环境或细胞因子的诱导下可分化为肝干细胞[B]。目前,在骨髓中已发现多种细胞亚群具有分化为肝细胞的潜能,如KTLS细胞(c-kithighThylowLin-Sca-1+)[H]、β2-m-Thy-1+细胞[12]、CD44-CD45-HLA-c-kit-的多能成体前体细胞(multipotent adult progenitor cells, MAPC)[I]及C1qRp+细胞(Lin-CD45+CD38-CD34+/-)[J]等。这些细胞均涉及多个不同的表面标志,可能代表着骨髓干细胞的不同发育阶段或谱系中的不同分支。这些细胞因子肯定存在于细胞的微环境中，包括细胞外基质中参与粘附过程的信号分子以及参与正常细胞发育、分化、成熟的细胞因子[B] [E]。Petersen 等[L]、Theise等[M,N]和Alison等[O]的研究相继指出,骨髓干细胞或造血干细胞能够在鼠肝内转化成为肝卵圆细胞甚至成熟的肝细胞和胆管细胞,并同时证明这种现象也存在于人类体内。用高浓度的肝细胞生长因子(HGF)诱导体外培养的大鼠骨髓细胞,RT-PCR检测到白蛋白及AFP的表达,免疫细胞化学也证实了经诱导的细胞出现了AFP、白蛋白及CK8/18等肝前体细胞的特征性表达。应用磁株细胞筛选法分离人或大鼠骨髓细胞中的β2m-Thy-1+细胞,能够表达肝细胞的特征[P]。这些骨髓来源的肝干细胞(BDHSC)肝内移植后很快就整合入肝板,并且分化为成熟的肝细胞,而在体外培养的过程中加入胆汁化血清可促进它们向肝细胞方向分化。蔡云峰等用免疫磁珠法成功分离出骨髓干细胞的多个亚群，并证明大鼠骨髓内β2微球蛋白阴性(β2 m- ) 细胞经体外培养诱导后呈多角形细胞表现, 白蛋白、AFP、 CK8 / 1 8表达阳性，其他干细胞类型未见类似变化。提示该亚群骨髓干细胞有向肝干细胞分化的能力。我们参照他们介绍的方法成功分离了1.5×105数量级的肝干细胞纯度为95%，培养7天后可达2×106数量级。经免疫组化染色证明其有肝细胞、胆管上皮细胞、血管内皮细胞的特异性标志，因此推测其可能分化为以上3种细胞（见研究工作基础）。这些研究结果都说明骨髓细胞中存在有能分化为肝细胞的干细胞群。

肝脏基因治疗的一大难题是被用作基因修饰的成熟肝细胞在体外不易扩增和传代，肝干细胞具有强大的增殖能力，即使经过基因修饰仍有可能传代，这为克服目前基因治疗中的主要问题开辟了新的途径。以肝干细胞作为载体具有一次性介入，永久性治疗的特点，且永生化的肝干细胞无致癌的危险性[F]。

基于以上研究成果，我们设想利用肝干细胞在肝脏汇管区中央静脉周围的靶向定植并在必要时分化补充受损或衰老的血管内皮细胞、胆管上皮细胞、肝细胞的生物学特性，以腺相关病毒为载体将DcR3基因转入从雄性近交系Wistar大鼠骨髓中分离纯化的肝干细胞，将雌性近交系Wistar大鼠肝脏植入雌性近交系Lewis大鼠，同时将转染DcR3基因的肝干细胞经门静脉注入移植后的肝脏。DcR3基因随着肝干细胞的定植主要在汇管区持续表达，必要时部分随着肝干细胞的进一步分化而表达在血管内皮细胞、胆管上皮细胞、肝细胞，从而在启动（主要）、攻击（次要）两个环节抑制排斥反应的发生。DcR3基因强大的免疫抑制作用被局限在肝脏之中，从而诱导出特异针对肝脏的移植耐受状态。

参考文献

1. Arnold B. Levels of peripheral T cell tolerance. Transplantation Immunology. 2002,10(2-3):109-114

2. Goddard S, Adams DH. New approaches to immunosuppression in liver transplantation. J astroenterol Hepatol.2002, 17(2):116-26

3. Petersen BE，Bowen WC，Patrene KD，et al．Bone mar row as a potential source of hepatic oval cells． Science．1999，284（5417）：1168－70

4. Mitaka T．Hepatic stem cells：from bone marrow cells to hepatocytes．Biochem Biophys Res Commun．2001，281（l）：l－5

5. Farber E．Similarities in the sequences of early histological changes Induced in the liver of the rat by ethionine，2-acetylaminofluorence，and 3-methyl-4-dimethyl aminoazobenzene．Cancer Res l955，16：142－8

6. Fujio K，Evans RP，Hu Z，et al．Expression of stem cell factor and its receptor，c-kit，during liver regeneration from putative stem cells in adult rat．Lab Invest．1994，70（4）：511－6

7. Petersen BE，Goff JP，Greenberger JS，et al．Hepatic oval cells express the hematopoietic stem cell marker Thy-1 in the rat．Hepatology．1998，27（2）：433－45

8. Baumann U， Crosby HA，Ramani P，et al．Expression of the stem cell factor receptor c-kit in normal and diseased pediatric liver: identification of a human hepatic progenitor cell？ Hepatology．1999，30（l）：112－7

9. Lemmer ER， Shepard EG，Blakolmer K，et al．Isolation from human fetal liver of cells co-expressing CD34 haematopoietic stem cell and CAM 5.2 pancytokeratin markers．J Hepatol．1998，29（3）：450－4

10.Lagasse E，Connors H，AI- Dhalimy M，et al．Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo．Nat Med. 2000，6（11）：1229－34

11.Gao Z, McAlister VC, Williams GM. Repopulation of liver endothelium by bone-marrow-derived cells. Lancet.2001,357(9260):932-933.

12.Avital I，Inderbitzin D，Aoki T，et al．Isolation，characterization，and transplantation of bone marrow derived hepatocyte stem cells．Biochem Biophys Res Commun．2001，288（l）：156-64

13.Daly AK, Day CP, Donaldson PT. Polymorphisms in immunoregulatory genes: towards individualized immunosuppressive therapy? Am J Pharmacogenomics. 2002, 2(1): 13-23

14.Pitti RM, Marsters SA, Lawrence DA, etal. Genomic amplification of a decoy receptor for Fas ligand in lung and colon cancer. Nature. 1998,396(6712): 699-703

A．Crosby HA, Gastroenterology,2001,120:534-544

B．姚 鹏,詹轶群,许望翔,等.细胞生长因子体外对大鼠肝干细胞的影响.中华肝脏病杂志,2003,11(1):33～36

C．赵春华(hsc3)

D.Alison MR.Liver 2001 21(6):376

E Suzuki A. Clonal identificationJournal of cell boil,2002, 156(1):173

F Allain JE, Immortalization. Proc Natl Acad Sci,2002,99(6),3696

G Theise ND.The canals of .Hepatology ,1999,30(6):1425-1433

H Lagasse E, Connors H, Al-Dhalimy M, et al. Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo. Nat Med. 2000 Nov6(11):1229-34.

I Schwartz RE, Reyes M, Koodie L, et al. Multipotent adult progenitor cells from bone marrow differentiate into functional hepatocyte-like cells. J Clin Invest. 2002 May109(10):1291-302.

J Danet GH, Luongo JL, Butler G, et al. C1qRp defines a new human stem cell population with hematopoietic and hepatic potential. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Aug 699(16):10441-5. Epub 2002 Jul 24.

K Van der Kooy D, Weiss S. Why stem cells? Science. 2000 Feb 25287(5457):1439-41.

L.PetersenBE,BowenWC,PatreneKD.etal.Bonemarrowasapotentialsourceofhepaticovalcells.Science,1999,284∶1168 1170.

M.TheiseND,BadveS,SaxenaR,etal.Derivationofhepatocytesfrobonemarrowcellsinmiceradiation inducedmyeloablation.Hepatology,2000,31∶235 240.

N.TheiseND,NimmakayaluM,GardnerR,etal.Liverfrombonmarrowinhumans.Hepatology,2000,32∶11 16.0 O.AlisonMR,PoulsomR,JefferyR.etal.Hepatocytefromnonhepatiadultstemcells.Nature,2000,406∶257.1

P.AvitalI,InderbitzinD,AokiT,etal.Isolation,characterizationandtransplantationofbonemarrowderivedhepatocytestemcellsBiochemBiophysResCommun,2001,288∶156 164.

2.项目的研究内容、研究目标，以及拟解决的关键问题。（此部分为重点阐述内容）

2.1 研究内容

2.1.1构建携带DcR3基因的腺相关病毒载体，并将其转染AAV293细胞，收集AAV病毒颗粒备用。

2.1.2从雄性近交系Wistar大鼠股骨、胫骨抽取骨髓，分离出肝干细胞，用上述腺相关病毒颗粒转染，并进行表达鉴定。

2.1.3将雌性近交系Wistar大鼠肝脏植入雌性近交系Lewis大鼠，同时将转染的雄性近交系Wistar大鼠的肝干细胞经门静脉注入肝脏。

2.1.4根据Y染色体及AAV病毒载体自带的绿色荧光蛋白（GFP）标志确定转基因肝干细胞在供肝中的定植、分布情况。

2.1.5检测转入肝干细胞的DcR3基因在供肝中的表达情况。

2.1.6观测肝移植术后移植排斥反应的发生情况。

2.2研究目标：本课题拟构建携带DcR3基因的腺相关病毒，将其转染雄性近交系Wistar大鼠骨髓来源的肝干细胞；将雌性近交系Wistar大鼠肝脏植入雌性近交系Lewis大鼠，同时将转染DcR3基因的肝干细胞经门静脉注入移植后的肝脏；使DcR3基因在供肝中长期表达，从而诱导特异针对肝脏的移植耐受状态。探讨：(1)转基因肝干细胞在供肝中的定植、分布情况。(2)转入肝干细胞的DcR3基因在供肝中的表达情况。(3)转基因肝干细胞在供肝中的分布及其基因表达与移植耐受的关系。

2.3拟解决的关键问题

2.3.1腺相关病毒转染肝干细胞的效率：干细胞的基因转染难度较大，是本课题的关键环节之一。本课题成员（删去）于2001年用腺病毒成功感染了神经干细胞，成功率约 80%～90%，且经传代培养 12代后仍具干细胞特性。腺相关病毒转染效率高于腺病毒，转染的细胞类型较腺病毒更广泛。因此本课题组有能力完成腺相关病毒对肝干细胞的转染。

2.3.2转基因肝干细胞在供肝汇管区中定植的数量：肝干细胞在汇管区的定植数量与肝脏受到的损伤程度有关。损伤越重，肝干细胞在汇管区的定植数量越多，反之亦然。肝移植时肝脏缺血再灌注对肝脏已是一种损伤，为了进一步提高肝干细胞在汇管区的定植数量，可在冷保存时切除大鼠肝脏的一叶，然后完成肝移植。

3.拟采取的研究方案及可行性分析。（包括有关方法、技术路线、实验手段、关键技术等说明）

3.1研究方案

3.1.1 DcR3基因的克隆，参照Pitti RM等介绍的方法进行。

3.1.2构建携带DcR3基因的腺相关病毒载体，并用其感染AAV－293细胞进行体外表达鉴定、收集AAV病毒颗粒备用。

3.1.3从雄性近交系Wistar大鼠股骨、胫骨抽取骨髓，分离肝干细胞并进行纯化、鉴定，参照Itzhak Avital等介绍的方法进行。

3.1.4腺相关病毒载体转染肝干细胞，采用直接感染方法。

3.1.5体外试验：表达DcR3基因的肝干细胞抑制FasL诱导淋巴细胞凋亡试验；表达DcR3基因的肝干细胞抑制FasL诱导的淋巴细胞趋化试验

3.1.6动物实验：大鼠肝移植采用袖套法，移植完成时将转染DcR3基因的肝干细胞经门静脉注入肝脏；分别于术后3天、7天、14天、21天、28天取血液及肝脏标本，采用常规生化法检测肝功能，Northern blot、Western blot检测DcR3基因在肝脏中的表达情况，免疫组化法检测受体CD4+、CD8+淋巴细胞在供肝中的浸润情况，TUNEL法检测供肝中细胞凋亡情况，常规石蜡切片HE染色观察移植排斥反应的发生情况。

3.2技术路线

3.3可行性分析

3.3.1理论上，骨髓来源的肝干细胞是肝脏汇管区卵圆细胞、嗜碱性小肝细胞的前体细胞。研究证明经门静脉注入的肝干细胞定植的肝脏汇管区的Hering小管，可分化为血管内皮细胞、胆管上皮细胞、肝细胞。汇管区是肝移植排斥反应时CTL细胞首先浸润的区域，血管内皮细胞、胆管上皮细胞、肝细胞是CTL细胞攻击的靶细胞。因此肝干细胞将转染的免疫抑制基因带入肝脏并汇管区及血管内皮细胞、胆管上皮细胞、肝细胞中持续表达，从而诱导特异针对肝脏的移植耐受状态在理论上是可行的。

3.3.2本研究所涉及的技术均为成熟的免疫学技术；本研究所拥有本研究所需的设备和条件。

4.本项目的特色与创新之处。

本研究利用了肝干细胞在肝脏定植、分化的靶向性，将其作为免疫抑制分子的载体，使非特异性的免疫抑制分子的作用局限于肝脏之中，克服了免疫抑制分子作用范围过大的缺点，从而诱导特异针对肝脏的移植耐受状态。

5.年度研究计划及预期研究结果。（包括拟组织的重要学术交流活动、国际合作与交流计划等）

年度研究计划

2005.01-2005.09 DcR3基因的克隆，构建携带DcR3基因的腺相关病毒载体备用。

2005.10-2006.06 分离、纯化、鉴定雄性近交系大鼠骨髓来源的肝干细胞，并用腺相关病毒进行转染；DcR3基因的体外表达鉴定；所转染的DcR3基因的体外功能实验。

2006.07-2007.06 完成肝移植的动物模型，将转染后的肝干细胞经门静脉注入肝脏。按期取肝脏标本，根据Y染色体标志染色及GFP，确定转基因肝干细胞在供肝中的定植、分布情况；检测转入肝干细胞的基因在肝脏中的表达情况；移植排斥反应的发生情况。

2007.07-2007.12 补充实验遗漏，整理实验资料，统计处理实验数据，撰写论文。

预期研究结果

1.证明转染DcR3基因的肝干细胞能在供肝汇管区及部分血管内皮细胞、胆管上皮细胞、肝细胞中持续表达，同时诱导出长期的肝移植免疫耐受。

2.在国外学术期刊上发表论文2-3篇，在国内核心期刊发表论文6-8篇，并在国内学术会议交流。

(二）研究基础与工作条件

1.工作基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）

2月底至3月初出结果。

2.工作条件（包括已具备的实验条件，沿缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况。）

删去

3.申请人简历（包括申请者和项目组主要成员的学历和研究工作简历，近期已发表与本项目有关的主要论著目录和获得学术奖励情况及在本项目中承担的任务。）

删去

（三）经费申请说明（要求按照《国家自然科学基金经费管理办法》认真填写，购置5万元以上固定资产及设备等，须逐项说明与项目研究的直接相关性及必要性。）

（四）其他附件清单（附件材料复印后随纸质《申请书》一并上交）（随纸质申请书一同报送的附件清单，如：具有中级技术职称申请者的推荐信或在职研究生申请项目的导师推荐信等。）

---