染色质免疫共沉淀的一般流程

ChIP 的一般流程：
甲醛处理细胞---收集细胞，超声破碎---加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合---洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联，纯化富集的DNA-片断---PCR分析。
在PCR分析这一块，比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR的普及，大家也越来越倾向于Q-PCR了。此外还有一些由ChIP衍生出来的方法。例如RIP（其实就是用ChIP的方法研究细胞内蛋白与RNA的相互结合，具体方法和ChIP差不多，只是实验过程中要注意防止RNase，最后分析的时候需要先将RNA逆转录成为cDNA）；还有ChIP-chip（其实就是ChIP富集得到的DNA-片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司的要求来准备样品）。
具体 *** 作流程：
第一天：
（一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。
1、取出1平皿细胞（10cm平皿），加入243 ul 37%甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9ml）。
2、37摄氏度孵育10min。
3、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0125M。450 ul 25M甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min即可。
4、吸尽培养基，用冰冷的PBS清洗细胞2次。
5、细胞刮刀收集细胞于15ml离心管中（PBS依次为5ml，3ml和3ml）。预冷后2000rpm 5min收集细胞。
6、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer。使得细胞终浓度为每200ul含2×106个细胞。这样每100ul溶液含1×106个细胞。再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设MCF7长满板为5×106个细胞。本次细胞长得约为80%。即为4×106个细胞。因此每管加入400ul SDS Lysis Buffer。将2管混在一起，共800ul。
7、超声破碎：VCX750，25%功率，45S冲击，9S间隙。共14次。
（二）、除杂及抗体哺育。
8、超声破碎结束后，10000g 4℃离心10min。去除不溶物质。
留取300ul做实验，其余保存于-80℃。
300ul中，100ul加抗体做为实验组；100ul不加抗体做为对照组；100ul加入4ul5MNaCl（NaCl终浓度为02M），65℃处理3h解交联，跑电泳，检测超声破碎的效果。
9、在100ul的超声破碎产物中，加入900ul ChIP Dilution Buffer和20ul的50×PIC。
再各加入60ul ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃颠转混匀1h。
10、1h后，在4℃静置10min沉淀，700rpm离心1min。
11、取上清。各留取20ul做为input。一管中加入1ul抗体，另一管中则不加抗体。4℃颠转过夜。
（三）、检验超声破碎的效果。
取100ul超声破碎后产物，加入4ul 5M NaCl，65℃处理2h解交联。分出一半用酚/氯仿抽提。电泳检测超声效果。
第二天：
（一）、免疫复合物的沉淀及清洗。
12、孵育过夜后，每管中加入60ul ProteinA Agarose/Salmon Sperm DNA。4℃颠转2h。
13、4℃静置10min后，700rpm离心1min。除去上清。
14、依次用下列溶液清洗沉淀复合物。清洗的步骤：加入溶液，在4℃颠转10min，4℃静置10min沉淀，700rpm离心1min，除去上清。
洗涤溶液：alow salt wash buffer-one wash
bhighsalt wash buffer-one wash
cLiCl wash buffer-one wash
dTE buffer-two wash
15、清洗完毕后，开始洗脱。洗脱液的配方：100ul10%SDS，100ul 1MNaHCO3，800ul ddH2O，共1ml。
每管加入250ul洗脱buffer，室温下颠转15min，静置离心后，收集上清。重复洗涤一次。最终的洗脱液为每管500ul。
16、解交联：每管中加入20ul 5M NaCl（NaCl终浓度为02M）。
混匀，65℃解交联过夜。
第三天：
（一）、DNA样品的回收
17、解交联结束后，每管加入1ul RNaseA（MBI），37℃孵育1h。
18、每管加入10ul 05MEDTA，20ul 1MTrisHCl（PH65），2ul 10mg/ml蛋白酶K。
45℃处理2h。
19、DNA片段的回收----omega胶回收试剂盒。最终的样品溶于100ul ddH2O。
（二）、PCR分析

第20章 细胞基因分离鉴定和原位杂交
第一节 细胞DNA、RNA的分离鉴定技术
一、培养细胞基因组DNA的提取及鉴定
人和哺乳动物细胞基因组DNA的分离通常是在有EDTA、Sarkosye等一类去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚、氯仿抽提，经RNase处理和纯化来提取DNA，可用于细胞凋亡中对所引起DNA断裂、凝胶电泳呈现“梯形”条带的实验，在细胞凋亡章节中已介绍了有关DNA的提取和凝胶电泳鉴定，除此之外，提取纯化的DNA还可用于分析其结构，序列限制性内切酶片断长度多态性及其基因定位和克隆。
(一)DNA提取方法：
(1)取单层细胞，经无钙、镁PBS洗一次，用025%胰蛋白酶消化，细胞悬液经PBS洗2次,弃上清，取细胞沉淀。
(2)加入2ml细胞裂解液(10mM Tris HCL，pH80，01mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1%SDS)充分混匀，加入蛋白酶K至终浓度为05～1g/L、Sarkosye终浓度为05%，混匀裂解蛋白呈糊状。
(3)50℃水浴2小时，转入37℃水浴过夜，次日加入等体积的饱和酚，轻轻颠倒混匀，以防止DNA断裂，约3分钟。
12000r/min离心15分钟（室温）
(4)取水相，再加入等体积酚/氯仿(1:1),同样颠倒混匀，去除蛋白质
12000 r/min离心15分钟（室温）
(5)再重复步骤(4)，再用等体积酚/氯仿(1:1)抽提一次
(6)取水相，再加入等体积氯仿，去除酚及蛋白质，颠倒混匀
12000 r/min离心15分钟（室温）
(7)取水相，加入2倍体积的预冷无水乙醇，沉淀DNA，混匀-20℃放置1小时
12000 r/min离心15分钟（室温）
(8)用70%乙醇洗涤一次，按上法离心将沉淀真空干燥10分钟。
(9)加入RNase A至终浓度100mg/L，37℃水浴消化1小时，消化污染的RNA。
(10)加入蛋白酶K至终浓度04g/L、Sarkosye至终浓度05%，混匀，50℃水浴2小时，加入Nace至终浓度10mmol/L。
(11)用等体积饱和酚各抽提一次，步骤同前。
(12)吸上清，加入氯仿/异戊醇(24:1)，按上法再抽一次。
(13)取水相，加入2倍体积预冷无水乙醇，-20℃ 1小时。
(14)取沉淀用70%乙醇洗一次，真空干燥10分钟后溶于少量TE中，4℃贮存。
(二)DNA纯度检测及含量计算
DNA浓度用紫外分光光度计测定，核酸的光吸收值位于波长260nm处，蛋白质则位于280nm，分别测定后，其OD260/OD280的比值应大于175低于此值，说明DNA中仍残留较多的蛋白质，此时可用酚、氯仿继续抽提纯化。若比值大于19表明DNA链破坏，断裂严重，已成为小分子，因此 *** 作应轻柔。
取少许DNA溶液，经紫外线扫描，吸收峰值位于波长260nm处，其纯度应为OD260/OD280=18
OD260值为1的溶液大约含50μg/mL DNA，故DNA的浓度(μg/mL)=OD260值×50mg/L×稀释倍数。
DNA总量(μg)=DNA浓度(μg/mL)×总体积(mL)
DNA分子量大小测定，可用含溴化乙锭的1%琼脂凝胶电泳法测定，根据加入标准品片断的电泳迁移距离计算样品片断分子量大小，此技术还可用作分离基因组DNA，进一步进行Southern吸印分析。
二、培养细胞总RNA的提取及鉴定
细胞中含有三类RNA即rRNA、mRNA和tRNA，其中mRNA传递蛋白质全部遗传信息是克隆表达功能性蛋白基因的最佳来源，是蛋白质合成的场所,有特殊意义,不同的细胞所表达某种蛋白的mRNA的种类和产量是不同的，为了提高细胞转录的mRNA的种类和产量，通常需加入诱导剂来对细胞进行刺激培养，如抗原、病毒、PHA、ConA、LPS等。
提取细胞总RNA的方法，常用强烈变性剂如盐酸胍溶液处理细胞，我们在细胞凋亡的bcl-2基因的RT-PCR法基因克隆中介绍了异硫氰酸胍一步法，但不纯，本文介绍用盐酸胍来裂解细胞可导致细胞结构破坏，核蛋白二级结构破坏，可利于提取总RNA，也可从总RNA中提取mRNA，从而分析mRNA表达量，建立cDNA文库，以及对mRNA的调控和进行反义RNA研究。
变性液：7mol/L盐酸胍，25m mol/L棕檬酸钠pH70，05%Sarkosye，01mol/L β-巯基乙醇。
水平衡酚：在饱和酚中加入等体积DEPC处理的三蒸水(或新鲜无菌的三蒸水)混匀后去除水相，再重复处理二次即可。
所用玻璃、塑料制品、金属器材可用01% DEPC水浸泡过夜后消毒无菌，其中玻璃、金属器材也可用180℃干烤6小时，以去除被污染的RNA酶。
(一)总RNA的提取方法：
1、消化收集细胞方法同前。
2、向离心管中的细胞沉淀物中加15mL变性液，立即充分混匀。
3、加入15mL水平衡酚、015ml 2mol/L乙酸钠PH40、以及005mL氯仿，剧烈振荡混匀30秒后，立即置冰上放置15分钟，4℃ 12000r/min离心15分钟。
4、取水相，加入等体积酚/氯仿(1:1)混匀，剧烈振荡10分钟，4℃12000rpm离心15分钟。
5、取水相，加入等体积氯仿，剧烈振荡10分钟，再同上离心，再如此反复抽提一次后取水相，加入等体积的预冷的异丙醇(或异戊醇)混匀，低温放置20分钟，再同上离心。
6、取沉淀用70%预冷乙醇洗两次，干燥10分钟，溶于DEPC处理的三蒸水中以溶解RNA，分装,-20℃冻存。
(二)总RNA的鉴定及含量计算
1、RNA纯度及含量测定
取少量提取的RNA，经紫外线扫描，吸收峰位于波长260nm处，RNA纯度为OD260/OD280=18～2。
OD260值为1的RNA溶液约含有40μg/mL，故RNA浓度(μg/mL)=OD260值×40μg/mL×稀释倍数。
2、RNA分子量大小鉴定
21 配液：
(1)10×MOPS电泳缓冲液配制
将412g[2-(N-玛琳代)丙磺碱，2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，MOPS]溶于800mL经DEPC处理的50mmol/L乙酸钠液中，用2mol/L NaoH调整pH至70，加入20mL经DEPC处理的05mol/L EDTA(pH80)，再加经DEPC处理的水至总体积为1000mL过滤除菌，避光室温保存。
(2)甲醛加样缓冲液：1mmol/L EDTApPH80、025%溴酚兰、025%二甲苯青FF、
50%甘油
22 *** 作步骤：
(1)制平板胶：12%琼脂糖煮沸，冷却至60℃，加入10×MOPS缓冲液及甲醛溶液，使三者的比例为35:11:1，或三者的终浓度分别为12%、1及10%，于室温放置30分钟或更长时间，使胶凝固。
(2)在无菌离心管中混合下列液体。
RNA(最多30μg) 45uL
10×MOPS电泳缓冲液 10uL
甲醛 35uL
65℃温育15分钟，水浴冷却、离心
(3)加入2ul DEPC处理的加样缓冲液上样，进行电泳，5V/cm电压，3小时直到溴酚兰至胶的中部，可用已知RNA标本作分子量标准品，如28srRNA或9S兔β-球蛋白mRNA。
(4)电泳完毕，取出凝胶，浸泡在溴化乙锭溶液中(终浓度05g/L)染色30～45分钟，紫外透射仪观察分子量大小。
第二节 核酸蛋白转移电泳及杂交
一、DNA Southern Blot及杂交
本技术可用于基因组DNA特定序列定位，尤其可分析某些基因的限制性内切酶长度多态性，对遗传性疾病的早期基因诊断、产前诊断或基因变异等方面的研究有应用价值，其过程包括：样品DNA内切酶水解、水解片断的琼脂糖凝胶电泳分离、分离后水解片断的转移(固定)、特异性DNA片断的分子杂交及放射自显影。
(一)样品DNA内切酶水解
限制性内切酶(RE)可裂解双链DNA，每种酶其特点是具有高度特异性的DNA裂解点和不同电离子强度的特殊反应条件。不同产品其反应条件不同，应根据说明书 *** 作。单位(U)RE活性是在37℃ 1小时内能将1μg DNA所有特异性位点切断的酶用量。若用两种以上不同的内切酶，要注意RE的最适盐浓度，要由低向高逐级添加适量盐逐个进行DNA切割。
1、配液：10×限制性酶消化缓冲液
10×buffer O—无盐：100mmol/L Tris HCL pH74
1mg/mL BSA
100mmoL/L MgCL2
10mmol/L DTT(二硫苏糖醇)
10×bnffer L—低盐：缓冲液O
05mol/L Nacl
10×bnffer H—高盐：缓冲液O
10mol/L Nacl
2、 *** 作步骤：
(1)将DNA(02～10μg)溶液加入EP管中,并加入适量H2O总体积为18μL，混匀。
(2)加入2mL 10×限制酶缓冲液，根据厂家建议的盐浓度选择不同的缓冲液。
(3)加1～2U限制性内切酶充分混合。
(4)37℃温育适当时间，时间需先进行预试验，摸索所需消化的时间，通常用琼脂糖凝胶电泳鉴定，酶解充分，各片断分子量从大到小分布均匀。
(5)加入05mol/L EDTA pH80使达到终浓度为10mmol/L终止反应。
(6)消化后的DNA直接进行琼脂糖电泳，方法同前，可用于分析或Southern Blot。
(二)Southern Blot及杂交。
将经电泳走在琼脂糖中的DNA变性、中和后，以毛细管作用在高盐缓冲液中转移至硝酸纤维膜上，再用放射性探针检测与之杂交的DNA。
1、配液：
(1)变性溶液：15mol/L Nacl 05mol/L NaoH
(2)中和溶液：200mL 20×SSC
100mL 1mol/L HCL
100mL 1mol/L Tris HCL pH80加水至500mL。
(3)20×SSC： 在800mlH2O中溶解1753g Nacl和882g柠檬酸钠，加入数滴10mol/L NaoH调pH至70加水至1000ml，高压消毒灭菌。
(4)预杂交液：125mL 1mol K3 PO4 pH74
125mL 20×SSC
25mL 100×Denhardt'S溶液
5mL 5mg/mL鱼精DNA
250mL 100%去离子甲酰胺
825mL H2O(总体积为500mL)
(5)100×Denhardt'S液：10g聚蔗糖(Ficoll400)
10g聚乙烯吡咯烷硐
10g牛血清白蛋白(组分V)
加H2O至500ml
2、 *** 作步骤(如图20-1)：
图20-1 Southern Blot装置图
(1)内切酶消化的DNA，总体积为50uL，加入10uL加样缓冲液进行12-24琼脂糖电泳。
(2)用溴化乙锭染色，紫外灯下观察并照像，在胶的旁边放一尺子。
(3)将电泳胶取出，用以下各溶液浸泡处理，同时轻轻摇动：
500mL 02mol/L HCL 10分钟，水洗若干次
500mL变性液中浸泡15分钟×2
500mL中和溶液浸泡30分钟。
(4)剪一张硝酸纤维素膜，每边小于胶3mm。
(5)剪3～5层滤纸，大小每边比硝酸纤维膜小7mm，再剪一张滤纸，比胶的宽度长30～40cm，在一盘中加入数百毫升20×SSC，盘上搭一块玻璃，滤纸可从玻璃双侧浸到盘中的溶液。
(6)逐层放置滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜，其上再铺滤纸及吸水纸，并加以重物，胶和硝酸纤维膜之间不可有气泡，转移24～36小时
(7)取出该膜，用圆珠笔标记方向，放入2×SSC中5分钟，用滤纸吸干,80℃烘烤2小时。
(8)将该转移膜放在塑料袋中，加入6～10mL预杂交液，排出气泡，封口，42℃ 3小时或过夜。
(9)将标记的DNA探针煮沸5分钟，立即冷却，加入杂交液中，浓度为5×105 CPM/ML。
(10)倒去预杂交液，加入含探针的杂交液封口，42℃ 6h或过夜。
(11)取出转移膜，按以下条件洗膜
1×SSC，01%SDS室温2×15分钟
025SSC，01%SDS,42℃ 2×15分钟，气中干燥。
(12)将杂交后的膜曝光于X光片，暗盒中放射自显影2～7天，-70℃。
(13)X片显影、定影，然后读片
结果分析：此杂交技术可以对基因结构进行分析。杂交阴性带的大小，分布规律及根据带条信号强度测量其含量。
二、RNA Northern Blot及杂交
此法是将RNA分子在变性琼脂糖凝胶中可相互分离，随后将RNA转移至硝酸纤维素滤膜上，用放射性标记的探针进行DNA-RNA杂交，此法是研究RNA(特别是mRNA)的主要方法之一，可测量RNA的含量和大小。
1、配液：Northern 预杂交液：125m 1mol/L K3PO4 pH74
125mL 20×SSC
25mL 100×Danhardt's液
5mL 5mg/mL 鱼精DNA
250mL 100%去离子甲酰胺
加H2O 至500mL-20℃贮存
Northern 杂交液：500mL预杂交液加入标记探针及10%磷酸葡聚糖。
2、 *** 作步骤：
(1)RNA变性电泳方法同前
(2)待溴酚兰走至胶的中部时，用水清洗胶数次，放置于500mL 10×SSC中浸泡45分钟，轻轻摇动。
(3)测量胶的大小，按下列顺序，从下向上为①横跨玻璃双侧的滤纸，双边可浸至20×SSC溶液；②胶；③硝酸纤维素滤膜；④亲和层吸纸；⑤吸水纸；⑥重物、转移4～6小时。
(4)取出滤膜80℃烘烤2小时。
(5)用6～10mL Northern预杂交液，42℃预杂交过夜。
(6)将已标记的探针煮沸，立即冷却，加入6～10mL Northern杂交液。
(7)去除预杂交液，加入含探针的杂交液，42℃，杂交过夜。
(8)按下列条件洗膜：1×SSC 01%SDS室温2×15分钟
025×SSC 01%SDS室温2×15分钟
(9)曝光于X光片暗盒中放射自显影1天。显影，定影，根据自显影条带的位置判定特定片断的位置和顺序，也可测含量。
三、蛋白Western Blot及分析
此项技术是一种蛋白质的固定和分析技术，是将已用聚丙烯酰胺凝胶或其它凝胶或电泳分离的蛋白质转移到硝酸纤维滤膜上，固定在滤膜上的蛋白质成分仍保留抗原活性及与其它大分子特异性结合的能力，所以能与特异性抗体或核酸结合，其程序Sonthern Blot相似，故称为Western Blot,第一抗体与膜上特异抗原结合后，再用标记的二抗(同位素或非同位素的酶)来检测，此方法可检测1ng抗原蛋白。
1、配液：
(1)转移电泳缓冲液：20mmol/L Tris HCL pH80
150mmol/L 甘氨酸
加145g Tris粉 6708g甘氨酸于4L水中，加入1200mL
甲醇，加水至6L
(2)丽春红S溶液：05%丽春红S
1%乙酸
2、 *** 作步骤（如图20-2）：
图20-2 Western Blot装置图
(1)用已制备好的SDS-PAGE分离的蛋白凝胶。
(2)用一张滤纸，剪成与胶同样大小，在转移电泳缓冲液中预湿，放在Scotch-Brit Pad上，在胶的阴性端放上滤纸，胶的表面用该缓冲液浸湿，排出所有气泡。
(3)在胶的阳极面放置同样大小浸湿的硝酸纤维素膜，排出气泡，再在滤膜的阳极端放置一张滤纸，排出气泡，再放一个Scotch-Brit Pad。
(4)将以上“三明治”样装置放入一个塑料支撑物中间，将支撑物放入电转移装置中，加入电转移缓冲液。
(5)接通电源：使胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜上，电压为14V 4℃转移4小时或过夜。
(6)将滤膜放入丽春红S溶液中5分钟，蛋白染色水中脱色2分钟，照像，用印度墨水将分子量标准染色，在水中完全脱色。
(7)将滤膜放在塑料袋中，每3张加入5mL封闭缓冲液(1克速溶去脂奶粉溶于100ml PBS中)，封闭特异性抗体结合位点，室温1h，摇动，倒出封闭缓冲液。
(8)在封闭缓冲液中稀释第一抗体，加入后室温放置1小时，将滤膜转到塑料盒中，用200mL PBS洗四次，摇动。
(9)在封闭缓冲液中稀释辣根过氧化物酶标记的二抗，重复步骤8。
(10)将滤膜放在100mL新配制的DAB底物溶液中，大约2～3分钟就可显色，用水冲洗终止反应、照像。
结果分析：分析阳性(显色)条带的分子量大小，而且根据信号(颜色)强弱分析蛋白表达量。
第三节 细胞的原位杂交技术
原位杂交(ISH)是一种可在细胞涂片、组织切片以及分裂中期染色体带中检测DNA或RNA的技术，此方法原理是由DNA或RNA的序列与互补的标记单链DNA/RNA探针结合形成标记的双链杂交分子，本技术可对组织细胞原位的待测核酸分子进行定性，定量及定位分析。在细胞分化调节、基因定位、肿瘤遗传学、分子病理学、病毒学等领域得到广泛应用。经典的原位杂交技术包括载玻片处理，组织细胞的固定，探针的制备或选购，原位杂交，洗涤以及检测，其中探针制备技术不属于本章专业技术，故不作具体评叙，略交待制备使用原则。本章节主要介绍培养细胞的原位杂交技术。
一、探针的制备原则和选择
探针为RNA或双链、单链DNA，双链探针较单链探针有很多缺点，探针必须变性、复性，降低了探针杂交效率，双链探针在溶液中形成长的链状结构倾向，限制了它的组织穿透能力。适用于基因组DNA杂交。由于原位杂交的探针将与高密度的细胞融合，因此，需要减短探针的长度或增加探针的浓度，但是过高浓度的探针往往会增加非特异性结合，因此每种探针应选择适当的浓度。
探针的获得常采用随机引物延伸法的PCR合成和扩增，可获大量的DNA探针，或利用带有噬菌体强启动子多克隆位点的质粒载体来合成RMA探针，也可利用质粒菌扩增质粒，经酶切后纯化的基因片断，均可以获得制备探针原料。这些探针可以用同位素标记，也可以用非同位素标记，即光敏生物标记或地高辛配基标记于脱氧脲嘧啶三磷酸核苷(dUTP)上形成的地高辛-dUTP，可通过随机引物或缺口平移法与探针的核酸分子相连，构成地高辛一配基标记的核酸探针。比探针可用抗地高辛抗体偶联酶或荧光素通过松体结合和底物显色或产生荧光来检测。
这些探针基本均有市售，无需自行制备，只要根据说明书使用即可。
二、载玻片和盖玻片预处理
为了防止探针的非特异贴附而保证细胞粘附而需处理：
1、用于检测RNA的载玻片的处理
(1)用01mol/L HCL洗载玻片20分钟，再用无水乙醇洗数次使其干燥。
(2)在下列溶液中，65℃处理2小时
3×SSC 002%FicoLL400 002%聚乙稀吡咯烷酮(PVP)。
(3)固定在乙醇/乙酸(3:1 V/V)20分钟，180℃烘烤2小时。
2、用于检测DNA的载玻片的处理
以TESPA(three-amino-propyl-triethoxy-silane)涂载玻片。
3、对于盖玻片：于01mol/L HCL中浸泡20分钟，用无水乙醇洗，干燥后用二甲基氯化硅硅化，180℃烤2小时。
三、组织细胞固定
理想的细胞固定过程应该保护细胞形态，同时确保目的基因DNA或RNA序列暴露。对于RNA-RNA原位杂交有效的固定剂是4%多聚甲醛和PLPD（磷酸缓冲液PBS、赖氨酸、过碘酸盐及重酪酸盐）。
1、涂片细胞原位杂交固定
(1)用含有002%EDTA的PBS洗涤细胞，于01%胰蛋白酶消化，收获细胞计数，涂载玻片上。
(2)若检测RNA，固定于4%多聚甲醛pH70，在4℃下放60分钟，PBS洗5分钟，系列乙醇脱水干燥，-20℃保存。
(3)若检测DNA，固定在4%多聚甲醛16～24小时，01mol/L Tris-HCL pH74洗2×5分钟，浸泡在下述溶液中2×5分钟：
025%(v/v)Tritonx-100；025%(v/v)Nonidet P40；01mol/L Tris-HCL pH74；再用01mol/L Tris-HCL pH74洗2×5分钟。
(4)在100μg/ml蛋白酶K，50mmol/L Tris-HCL PH80，5mmol/L EDTA溶液中，37℃处理10分钟，再用含有甘氨酸的01mol/L Tris-HCL PH74洗2×5分钟。
(5)在20%(v/v)乙酸中40℃处理15分钟，01mol/L Tris-HCL PH74洗2×5分钟。
注意：对于DNA-DNA原位杂交多聚甲醛或福尔马林均可，但对于地高辛检测法必须用4%多聚甲醛，固定至少16小时，而且用蛋白酶K处理，这样可明显减少背景染色。
四、原位杂交
原位杂交与盐浓度、温度、甲酰胺浓度、pH等有关，DNA复性的温度是16～32℃，DNA-RNA原位杂交，25℃最佳，RNA-DNA杂交，可用较高温度，在pH5～9范围内复性率基本上与pH无关。最好选用温和的碱性条件。甲酰胺有机溶剂可降低双链核酸的稳定性，可避免杂交过程中处于过高的温度，防止高温破坏组织。
(一)同位素标记DNA探针的原位杂交
同位素标记的DNA探针，敏感性高，但要注意非特异结合，如35S标记探针在杂交前，用未经标记的dUTP预杂交，可减少非特异，可获较好的细胞内定位，此外还常用3H或125I标记探针，但3H放射线弱，自显影需100天曝光，不太理想，方法如下：
(1)取已形成单层的细胞的盖玻片，悬浮细胞可采用离心法，将细胞粘附到涂有明胶的载玻片上。组织印片，冰冻切片等标本。
(2)将标本浸入甲醇固定5分钟，再过3次4℃预冷的10%三氯醋酸。
(3)将细胞片标本浸入70%乙醇脱水，空气干燥，这时培养细胞盖玻片应该用中性树胶固定于载玻片上，注意细胞面向上。
(4)将细胞片放置在金属盘内，并将托盘放入43℃水浴箱中预热。
(5)直接向固定的细胞面滴加5mL含探针杂交液，然后用16mm盖玻片覆盖，其边缘用橡胶液封闭。
(6)43℃恒温水浴箱内培养18小时，此间保持箱内高湿度，防止因盖玻片封闭不严导致杂交缓冲液干涸。
(7)反应结束后，将玻片置于冰块上，用镊子小心剥下盖玻片周边的橡胶，将载玻片浸入垂直2×SSC溶液中，使盖玻片脱落。
(8)将载玻片放入湿盒中，加2×SSC溶液浸没玻片，加盖玻片并用胶带封闭湿盒。然后，将湿盒移入水浴箱中53℃处理30分钟。
(9)在18℃用2×SSC洗玻片4次，每次5分钟。
(10)玻片浸入70%乙醇脱水，空气干燥。
(11)将干燥后的干燥标本浸入新配制的核4乳胶液（核4乳胶液蒸馏水=1:1），垂直取出玻片，用滤纸擦去背面多余胶，室温干燥5小时（在暗室中进行）。
(12)用黑纸包裹标本放在4℃冰箱曝光（3H标记的探针通常需2～4周，有时需长达100天，可造成高背景，而不理想）。
(13)按常规显影、定影、水洗。
(14)对标本进行Giemsa或HE染色、脱水、封片。
结果分析：镜下观察，如需定量，可在镜下计数银颗粒或拍摄显微照片，用图象分析仪进行灰度分析。
(二)同位素标记RNA探针的原位杂交
RNA探针容易制备，合成率较高，成本低，易纯化，可提高检测敏感性。DNA-RNA、RNA-RNA杂交比DNA-DNA杂交稳定，能适应更多的条件。
(1)标本处理同前
(2)将RNA标记探针溶于杂交缓冲液中（5×107CPM/ml放射强度）。
50～70%去离子甲酰胺 2×SSC
05×Denhardt's液 1mmol/L EDTA pH70
200μg/mL变性鱼精DNA 85℃ 5分钟
(3)每张载玻片上滴加杂交液，使每张载玻片探针总量为2×105CPM，用一硅化的盖玻片盖住，封以不透性矿物油，在利于探针的温度下（常为42℃）杂交7～18小时。
(4)用氯仿洗数次，去除矿物油，室温下使盖玻片在2×SSC液中滑落，再滴加50%～70%去离子甲酰胺，01×SSC液，杂交温度下60分钟，室温2×SSC洗5分钟，用50μg/mL RNaseA在2×SSC中消化去除单链RNA，再滴加50%～70%去离子甲酰胺，01×SSC,室温15分钟，室温下用01×SSC洗5分钟。
(5)将切片脱水，浸入由1%甘油稀释的放射自显影乳剂（1:1）中，放入暗盒中，在有硅胶干燥剂存在下-70℃，存放5天（或者曝光于X光胶片24～48小时），随后浸于液体乳剂。
(6)用HE染色。
(三)地高辛标记的DNA探针原位杂交
放射性同位素标记探针缺点是有放射损伤，易污染环境，需特殊防护和实验条件，有半衰期受限、标记不稳定及曝光时间长。若改用生物素、乙酰氨基、荧光或地高辛标记可避免，其中以地高辛标记探针最敏感，随机引物标记地高辛，其标记率很高，此探针用于原位杂交可获高敏感性，好的细胞定位以及低背景。非同位标记探针还可以通过双标记原位杂交法，同时测多条DNA序列。
(1)配液：①杂交缓冲液：2×SSC
5%（W/V）磷酸葡聚糖
50%去离子甲酰胺
②缓冲液I： 01mol/L Tris-HCL pH75
05mol/L Nacl
③缓冲液II： 01mol/L Tris-HCL pH95
01mol/L Nacl
5mmol/L MgCl2
(2) *** 作步骤：
①组织标本处理同前。
②将140ng/mL地高辛标记的探针加到杂交缓冲液中，每张滴加50μL杂交缓冲液，用盖玻片盖住，四周封以树胶。
③将目的DNA和DNA探针放入90℃，进行变性10分钟，双链打开，42℃，在潮湿环境中杂交16小时。
④去除盖玻片，按下列条件洗涤：
2×SSC室温10分钟→2×SSC室温10分钟→02×SSC室温10分钟→02×SSC 42℃ 20分钟。
⑤再按以下方法处理：
1) 在缓冲液I中洗30分钟。
2) 在含有20%羊血清的缓冲液I中洗30分钟。
3) 滴加1:5000标有碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶的地高辛抗体，在装有缓冲液I的湿盒中温育20分钟。
4) 在缓冲液I中洗2×20分钟。
5) 在缓冲液II中洗60分钟。
6) 加入下述溶液：缓冲液II
033mg/mL 四唑氮兰
017mg/mL 5-bromo-4-Chlora-3-indoly' phosphate
7) 将切片浸于20mmol/L Tris-HCL pH75，5mmol/L EDTA终止反应。
⑥ 用底物显色、复染、脱水、封片，按免疫组化常规法进行。
说明：
(1)用不同浓度和不同温度的盐溶液洗涤是为了去除探针与不完全同源序列杂交，减少非特异性显色，其原则盐浓度由高到低，温度由低到高洗涤，洗涤过程中切勿使切片干燥。
(2)应该有阳性和阴性对照，阳性对照：用该探针与已知含互补序列的组织细胞标本进行杂交。阴性对照：①应用RNA酶或DNA酶去除目的序列；②使用未标记探针；③不加核酸探针进行杂交（空白对照）；④用不含探针DNA的无关质粒DNA替代探针进行杂交；⑤同义RNA（Sense probe）进行杂交。

质粒的抽提与纯化实质上是将质粒DNA与细菌的基因组染色体DNA、RNA、蛋白质、细胞膜等细 胞器及其他大分子物质分离的过程，因此质粒的抽提大致可分为：细菌的培养、收集与裂解；质粒DNA 的分离与纯化；浓度、纯度的鉴定三个过程。

①染色体DNA的去除 ：在富集培养目标菌种后，首先应裂解细菌细胞，采用含有SDS的NaOH溶液裂解菌体释放质粒，同时氢氧化钠的强碱性，可使DNA氢键断裂，双螺旋结构破坏而变性，再加入中和缓冲液，可使部分变性的质粒DNA复性，而染色体DNA不复性，因此使质粒DNA与染色体 DNA分离开。

②细菌中的RNA可以通过RNaseA去除

③蛋白质的去除 ：细菌中的蛋白质可以通过酚/氯仿/异戊醇抽提，酚可以使蛋白质变性，氯仿将微溶 于水的酚抽提到有机相中，使其与水相中的DNA分离。分离后的质粒DNA可以通过乙醇回收，乙醇可以消除核酸水化层，暴露其带负电的磷酸基团，因 此在阳离子充足的环境中可以发生”核酸–乙醇沉淀

④蛋白质、染色体DNA、细胞碎片、以及在分离过程中与试剂形成的不溶复合物都可以通过离心去除。

⑤试剂盒法DNA的回收 :除碱裂解法以外，还可以通过试剂盒抽提质粒DNA，在碱裂解进行变性和复性后的纯化回收通过纯化柱进行。纯化柱中的硅胶膜能在高盐、低PH条件下吸附体系中的 DNA，将其与其他杂志分离，而在低盐、高PH条件下DNA又可以被洗脱下来。

⑥纯化后的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳或紫外分光光度计鉴定

电泳法 ：带负电荷的DNA分子在外加电场的作用下向正极泳动，不同分子量大小与构型的DNA分子泳动速率不同，因此可以在琼脂糖凝胶上呈现不同的条带。在凝胶中加入核酸染料可以方便我们观察，因为核酸染料可以嵌入到DNA碱基之间，避免被凝胶中的氢离子淬灭，因而亮度更高。

紫外分光光度法 ：DNA的吸收峰在260nm处，蛋白的吸收峰在280nm处，因此可以用OD260/OD280判断DNA纯度，一般认为比值在18~20之间时，纯度较高

材料：

含有pSK II质粒的大肠杆菌菌株的菌液、含有MP3质粒的大肠杆菌菌株的菌液

试剂：

①细菌的培养：LB培养基、氨苄青霉素

②细菌的裂解与收集：溶液I（Tris-HCl、EDTA、Glucose）、溶液II（NaOH、SDS）、溶液 III（KOAc、CH3COOH）、RNAseA
③质粒DNA的分离与纯化：酚/氯仿/异戊醇、无水乙醇、70%乙醇、1XTE溶液（Tris-HCl、 EDTA）、东盛生物小提质粒盒
④电泳：琼脂糖、05XTBE电泳缓冲液、StarGreen DNA Dye、loading buffer、1XTE buffer
①细菌的培养：
将含有pSK II和MP3质粒的大肠杆菌菌液分别于LB培养基上划线 → 37℃过夜培养 → 挑取培养基上的单菌落于液体LB培养基中，震荡培养过夜
②细菌的收集与裂解
- 碱裂解法
吸取15ml菌液12000rpm离心1min (沉淀菌体)
↓
弃上清培养液 (完成细菌的收集)
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加入150ul溶液I和3ul RNaseA，震荡混匀，静置2min (悬浮菌体、去除RNA)
↓
加入250ul溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮(不超过5min。裂解菌体、释放质粒，此步骤动作轻柔，防止基因组DNA断裂，且时间不宜过长)
↓
加入180ul溶液III，颠倒混匀，冰浴10min （中和反应，防止基因组DNA污染）
↓
12000rpm离心5min，吸取上清80ul，重复此 *** 作 (此时已完成了染色体DNA、RNA、细胞碎片、部分 蛋白质的分离)
③质粒DNA的分离
加入53ul的酚/氯仿/异戊醇上下颠倒抽提10min，静置分层 （DNA在水相中），12000rpm 离心10min
↓
通风橱中吸取上清，加入20体积的无水乙醇 （发生核酸-乙醇沉淀）
↓
12000rpm离心5min,倒掉乙醇，短暂离心10s，用移液q吸取乙醇
↓
加入500ul 70％乙醇洗涤DNA沉淀，离心5min，倒掉乙醇，离心10s，用移液q吸取乙醇，将其放置在通风橱中促进乙醇挥发
↓
加入300ul 1XTE溶解，65℃热板温育10min
④纯化质粒DNA
加入1XTE使溶液为300ul，加入300ul酚/氯仿，充分震荡抽提5min(去除蛋白)
↓
12000rpm离心5min，吸取上清
↓
加入1/10体积3M NaAc和2倍体积的预冷无水乙醇，混匀
↓
置于-70℃冰箱15min沉淀DNA
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4℃12000rpm离心15min，倒掉乙醇，离心10s，用移液q吸去乙醇
↓
05ml 70%乙醇洗DNA沉淀一次，离心2min，倒掉乙醇 （去除DNA中的盐离子）
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离心10s，移液q吸去乙醇，在50-60℃热板上烘干1min
↓
加入20ul 1XTE溶解DNA沉淀，并在65℃热板上温育10min （使DNase失活）

-试剂盒抽提法

加入溶液III离心后的上清液置于DNA纯化柱中，静置2min
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12000rpm离心1min，弃滤液 （DNA被吸附到硅胶膜上）
↓
加入500ul溶液PB，12000rpm离心1min，弃滤液 （洗脱蛋白、盐等杂质）
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加入500ul溶液W，12000rpm离心1min，弃滤液 （重复此步骤一次，洗掉多余盐离子及乙醇）
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12000rpm离心3min （彻底去除纯化柱中残留的液体）
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将DNA纯化柱置于新的离心管中，向纯化柱中央处悬空滴加80ul溶液Eluent，室温静置2min （将硅胶吸附柱上的质粒DNA洗脱下来）
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12000rpm离心1min （管底即为质粒DNA）
⑤琼脂糖凝胶电泳观察
制胶：
称取12g琼脂糖加入盛100ml 05XTBE电泳缓冲液的250ml 三角瓶中，摇匀
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微波炉加热至琼脂糖溶解（沸腾）
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放在冷水中冷却，加入10ul的StarGreen DNA Dye，摇匀
↓
琼脂糖倒入模具中，插上梳子 。凝固后向上垂直拔出梳子，将凝胶转移到电泳槽中，加入05XTBE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1mm
点样：
按照碱裂解法纯化前的MP3、pSK II样品各3ul、5ul Marker（10ug/ul、20ug/ul、60ug/ul）、碱裂解法纯化后的MP3、pSK II样品各6ul，试剂盒提取的MP3、pSK II样品各2ul的顺序依次加入点样板小孔中，再分别加入10Xloading buffer，配置10ul点样体系，吹吸混匀
电泳：
打开电源开关，调节电压3-5V/cm
观察：
将电泳好的凝胶置于凝胶成像仪中观察

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