touch down PCR的程序是怎么样的？

就是在设置退火那一步时，大部分脊改机器都自带一个程序，你可以每个循环降低或增加多少银圆度，樱搏判例如你设置的是每循环减少0.5度，起始退火温度是60度，那么第二个循环就是59.5度，第三个循环就是59度，依次递减，增加也可以

touchdown PCR是为了增加反应的特异性，降低非特异产物的产裂瞎生。在整个反应过程是一个温度由高到低的过程，在温度降低的过程中，会出现一个温度是上下游引物最适的退火温度，大量引物与模板结肆迅空合，由此产生特异性产物；温度继续降低时，未结合的引物已很少或没有，非特异性产物就很少或没有。

设置温度时，高温以Tm较高的引物为准，低温以Tm较低的引物昌肆为准.

我常用的程序是：65C----50C, 1C/2s(2s 降低1度）

Touch down(TD)PCR是一种特殊技术。采用它我们可以不需做预实验来进行条件选择，只需要做一次正式实验，就可能保证此次扩增试验在即使不是最佳也是在比较理想的条件下进行的，绝大多数情况下都可以获得理想的扩增效果。

其基本 *** 作是：根据对引物Tm值的计算，确定一个退火温度的大范围（不是一个点，而是一个可以跨越10～20度的范围），计算的Tm值应落在这个范围中间。在做扩增周期程序设定时，让退火温度从选定范围的最高温度开始逐步降低温度，每次降低一度，最后结束在选定范围的最低温度处。在每一个停留温度上循环两次。这样，引物在某一较高温度下与模板复性并引发延伸合成产物，通常是特异性扩增产物，因为它是在最早也即Tm值较高的条件下引发合成的，在随后退火温度继续下降的过程中，上述的延伸合成会继续进行。可以想象，在退火温度下降过程中，很有可能引物还会在模板上找到第二个复性并引发延伸的部位，但是由于该位点是在更低的Tm值下与引物复性的，故通常是“假阳性扩增”。这两个产物在含量上有极大区别。如果特异性扩增带与假阳性带之间的Tm值相差3度，由于在每个温度上进行两次循环，故特异性较高的合成产物经过了6次循环后假阳性产物才开始合成，故特异性产物的量大于假阳性产物的64倍（26），两者在量上是不难区别的。

touch down pcr就是降落pcr，可以选定一个温度范围，如50——35，每个温度2循环，然后在50度15循环。其原理是，随着退火温度的降低，特异性逐步降低，但特异性条带在温度较高时已经扩增出来，其浓度远远超过非特异性条带，随着退火温度的降低，特异性条带优先被扩增。这种方法的退火温度范围较大，在不知道最佳退火温度时比较适用。

降落PCR通过在PCR的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性，循环在比估算的Tm高大约5度的退火温度下开始慎芹含，然后每循环降低1度到2度，直到退火温度低于Tm5度。只有同源性高的目的摸板会被继续扩增 ，这些产首信物在随后的循环中继续扩增，并会将扩增的非特异性产物排挤出去。降宽笑落PCR对于那些不了解引物和目的摸板同源性程度的方法较为有用，如AFLP DNA指纹分析。

这是标准的touchdown PCR

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