甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案的本方案旨

在为全国流感监测网络实验室提供甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案，不用作商业活动或赢利目的。

一、标本的采集种类和要求

1、推荐采集的呼吸道标本种类

疾病发病后应尽快采集如下标本：鼻拭子、咽拭子、鼻腔吸取物、鼻腔冲洗液。气管插管的病人也应收集气管吸取物。标本应置于无菌病毒采样液，并立即用冰块或冰排保存或置于4 ℃ （冰箱），并马上送至实验室。（临床样品采集人员及实验室检测人员的感染控制指导请见相关文件。） 采样同时填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单。（附表1）

2、拭子的选择

标本应使用头部为合成纤维的拭子（例如，聚酯纤维），用铝或塑料做柄。不推荐棉拭子和木柄。标本采集管应包含3毫升病毒采样液（含有蛋白质稳定剂，阻止细菌和真菌生长的抗生素，缓冲液）

3、临床标本储存要求

保存在4℃（不能超过4天）或者-70℃或-70℃以下。有条件的实验室均应保存在-70℃或-70℃以下。不应保存在-20℃。

4、标本的分装处理

标本送至实验室后，立即进行处理，避免反复冻融。将原始标本分为三份，一份用于核酸检测，一份用于病毒分离，一份保存待复核。

5、标本的运输

疑似人感染甲型H1N1感染病例列为 A类，用UN2814包装运输。填写疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单（附表2）。

二、核酸检测

基于PCR原理的核酸检测方法是一种快速有效的诊断方法，在突发传染病应急工作中发挥了巨大作用。

1、基于real-time RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物和探针序列为美国CDC设计）：

4月29日WHO网站上公布了美国CDC设计的针对此次甲型H1N1流感病毒的real-time RT-PCR引物和探针，此实验用于检测疑似甲型H1N1流感病例的呼吸道样本, 因此，用此real-time RT-PCR的方法，建议首先筛选甲型流感病毒并排除季节性流感病毒和H5N1禽流感病毒。real-time RT-PCR方法参见附件3（中文翻译版），附件4（英文原版）。

2、基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒（引物序列为国家流感中心设计）：

目前国家流感中心设计了RT-PCR方法检测新的甲型H1N1流感病毒。RT-PCR的方法参见附件5。

三、病毒分离鉴定

可采用鸡胚和/或MDCK细胞进行流感病毒分离。具备相应条件的网络实验室在收到标本后24h内进行病毒接种。具体方法参见附件6和7。

四、适用于实验室工作人员的甲型H1N1流感病毒生物安全

（一）实验室级别及个人防护

1、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的诊断性实验工作，在BSL-2实验室内进行。所有样本 *** 作均应在生物安全柜（BSC）内进行。遵循生物安全三级个人防护。

2、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的病毒分离培养工作，应在BSL-3实验室内进行，并遵循生物安全三级个人防护。

（二）健康监测

1、所有人员均应自测发热及其他症状。

2、感染甲型H1N1流感病毒的症状包括咳嗽、喉咙痛、呕吐、腹泻、头痛、流鼻涕和肌肉疼痛。如有不适，应立即向上级报告。

3、如有人员在无防护情况下暴露于甲型H1N1流感确诊病例的临床标本或活病毒，应考虑在暴露后的7天时间里使用奥司他韦或扎那米韦进行抗病毒药物预防。

五、附表和附件

附表1 疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单

附表2 疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单

附件3： real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感 *** 作规程(2009版)（中文）

附件4： real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感 *** 作规程(2009版)（英文）

附件5： RT-PCR方法检测甲型流感病毒

附件6：甲型H1N1流感病毒鸡胚分离方法

附件7：甲型H1N1流感病毒MDCK细胞分离方法

附表1

疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本采样单 姓名 性别 年龄 职业※ 现住址 发病日期 标本#

种类 标本量

（g或ml） 采集

日期 备注 ※选项：参照传染病报告卡。

#选项：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）

采集人员： 采集单位（盖章）：

附表2

疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本送检单 姓名 性别 年龄 职业※ 现住址 发病日期 标本#

种类 标本量

（g或ml） 采集

日期 备注 ※选项：参照传染病报告卡

#选项：A鼻咽拭子、 B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）

标本量：如果同一份标本有多个包装请注明。

填表人员： 送样时间： 单位（盖章）：

附件3

real-time RT-PCR方法检测甲型H1N1流感 *** 作规程

中文翻译版（请同时参考英文原版）

请注意：体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。本规程中的体系仅供参考。

美国CDC实时RTPCR(rRTPCR)检测猪流感 *** 作规程(2009版)

本规程所有权归属疾病控制中心，紧急状态时授权各公共卫生实验室使用。本规程不用作商业活动或赢利目的。

一、概 述

（一）前提

本规程基于对rRT-PCR方法的基本掌握。

（二）实验原理

实时荧光定量RTPCR(rRTPCR)法检测猪流感的方案是用一组寡核苷酸引物和双重标记的TaqMan®探针，对呼吸道样本或体外培养的猪流感病毒进行定性检测鉴定。InfA引物和探针为检测出甲型流感病毒而设计，swInfA引物和探针可特异性地检测出所有的猪甲型流感病毒，swH1引物和探针可特异性检测猪流感病毒H1亚型。本实验用于检测甲型流感阳性的疑似猪甲型流感感染病例的呼吸道样本。

（三）使用条件

一步法定量RT-PCR 96孔板热循环系统。

（四）生物安全要求

样本处理应在相应的生物安全实验室完成。

（五）样本要求

1、呼吸道样本

支气管肺泡灌洗液，气管抽吸物，痰，鼻咽或口咽洗液或拭子。拭子样本所用的拭子顶端应为人造材质（如聚脂或涤纶）、柄为铝制或塑料。不推荐使用棉头木柄的拭子。藻酸钙拭子采样不可取。

2、排除标准

1）未在2－4°C (≤4 天)或-70°C及以下保存的样本

2）以上未列的其它不当样本

（六）核酸提取

RT-PCR扩增效能依赖于样本模板RNA的质与量。RNA提取 *** 作需经过检验核酸的纯度合格之后，再用于样本实验。商业化的 *** 作程序中包括QIAamp® 病毒RNA提取试剂盒，RNeasy®小试剂盒 (QIAGEN公司)，罗氏MagNA Pure Compact RNA分离试剂盒, MagNA Pure LC RNA分离试剂盒II, 和罗氏MagNA总核酸纯化试剂盒，在推荐的 *** 作程序下，可提取高纯度的RNA。

（七）免责声明：提到的厂家名仅用作举例，并不表示疾控中心认可。

二、实验材料

（一）试剂

1、一步法荧光定量RT-PCR探针试剂盒；

2、分子级无菌蒸馏水 (无RNA酶和DNA酶)；

3、正反向引物 (40μM)；

4、双重标记探针(10μM)；

5、阳性对照。

（二）供给

1、实验室标记笔；

2、微量离心管格栅，96孔02ml PCR反应管；

3、20μl 和 200μl 可调节移液器及滤芯q头；

4、02ml PCR 反应管盘；

5、光学反应盖板；

6、无菌,无核酸酶的15 ml微量离心管；

7、一次性无粉手套。

（三）仪器设备

1 微量离心机；

2 漩涡振荡器；

3 实时荧光定量PCR检测系统，含96孔的热循环反应板。

三、 *** 作程序

（一）准备工作

1 避免样品污染

由于fluorogenic 5’核酸酶测定的敏感性，应特别注意假阳性产生。推荐以下预防污染的方法：

1）实验准备与核酸提取使用独立区域；

2）实验准备与核酸提取使用专用设备（如移液器，微量离心机）和耗材（如微量离心管，吸头）；

3）实验开始后穿清洁工作服，并使用新的一次性无粉手套；

4）不同样本 *** 作之间，以及怀疑可能污染的情况下均更换手套；

5）试剂和反应管的盖子应尽量关闭。

2、仪器准备

工作台、移液管、离心机必须清洁，用去污剂净化，例如5%的漂白剂、“DNAzap”或者“RNase AWAY®”来减小核酸交叉污染的风险。

3、试剂准备

注意：在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。

1）引物和探针

（1）分装好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8℃可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）；

（2）涡旋振荡引物和探针；

（3）瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。

2）Real time RT-PCR的试剂

（1）将Master Mix和酶置于冰架上；

（2）融化2×的Reaction Mix；

（3）颠倒混合2×的Reaction Mix；

（4）瞬时离心2×的Reaction Mix和酶，置于冰架上。

4、对RT-PCR的每一步过程均进行检测

1）每个样品的RNA提取物通过分别的引物和探针进行检测：InfA, swFluA, Swine H1 (swH1) 和RNaseP (RP)。RNaseP引物和探针是以人的RNaseP基因为靶基因的，因此对于人的核酸可以作为内部阳性对照。

2）对于每一个过程中包括的所有引物和探针，均设立无模板对照（NTC）和阳性模板对照（PTC）。

3）人类样本对照（HSC）提供了次级阴性对照，以便确认核酸提取过程和试剂的完整性。

5、建立反应

反应检测混合物充分混合后加入到96孔板中。然后在适当的实验反应和对照中，加入水和提取的核酸或者阳性模板对照（PTC）。

1）为每一个引物和探针标记一个15ml的微量离心管；

2）对每一个建立的反应确定反应数（N）。考虑到NTC、PTC、HSC反应和吸量误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：

（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；

（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。

3）Master Mix:计算加到每个引物/探针反应混合物中的各个试剂的量。计算如下：

体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。

4）加入水之后，通过上下吹打混匀反应混合物，不要涡旋振荡。

5）离心5s使混合物聚集管底，然后将管子置于冰架上；

6）准备板状的反应管子或者96孔板，置于冰架上；

7）每一个master mix吸取20μl到每一孔中，每排按顺序进行，如下图：

实验建立举例：

实验样本举例：

注意：在任何样本被加入之前，应该首先加入阴性模板对照（NTC）（第1列），用来检验master mix中的污染。HSC应该在待测样本之后加入（第11列），用来检验在样本准备或者加入过程中的交叉污染。阳性模板对照（PTC）应该在所有样品和阴性模板对照（NTC）之后被加入。

8）在将培养板移到核酸处理区域之前，在试验设定区域，在反应板的第一列将NTC反应进行。如上所述。

9）吸取5μl的nuclease free water到NTC孔，将NTC孔盖上。

10）将反应板盖上，移到核酸处理区域。

11）将含有样品的管子涡旋振荡5s，瞬时离心5s；

12）将提取的核酸样本置于冰架上；

13）如上所述，样品应该按列加入，吸取5μl的第一种样本到所有标记这种样品的孔中（例如，样本“S1”如上表格所示）。不同样本之间需更换q头 *** 作。

14）加完样本的孔要盖住，这将会帮助防止样品的交叉污染，并且能够使 *** 作人员记录其加样的具体进程；

15）为了避免交叉污染，必要时更换手套；

16）对剩下的样本，重复步骤13-15；

17）加入5μl的HSC样品加到HSC孔中（第11列）。将HSC孔盖盖。

18）最后，加5μl阳性模板对照RNA到所有PTC孔中，将PTC孔盖上。

19）如果使用8个管子的条状板子，每一条都要做标签标记，来指明每一个样品的位置（不要在反应管子的顶部标记！）。瞬时离心条状管子10－15s，然后置于冰架上。如果使用培养板，4℃，500g离心30s，置于冰架上。

6、RT-PCR扩增条件

反应体系为25ul，反应条件如下：

注：在55度这一步骤中要收集荧光信号（FAM）。

具体扩增条件请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。

7、解释说明/检验

1）探针/引物的阴性对照反应中得到的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果一个或者多个引物和探针的阴性反应出现了假阳性，则样品可能已经被污染。那么整个实验过程是无效的，严格的按照步骤规则重新实验。

2）在37个循环处或者37个循环之前，所有的临床样本的RP反应曲线都应该超过阈值线，这表明从人类RNase P基因扩增到足够量的RNA，也表明了样本质量合格。然而，可能有些样本会由于初始临床样本中的细胞数量较少而无法出现阳性结果。同时，从动物/禽类体内或者经细胞培养得到的样本，经常会RP反应没有结果或者结果很弱。如果在所有临床样本中检测RNase P都阴性，则说明：

（1）从临床材料中对核酸的不适当的提取导致RNA的损失或者来自临床标本的RT-PCR抑制剂的残留污染；

（2）没有足够的人类细胞以备检测；

（3）方法建立和实施不当；

（4）试剂和仪器原因。

3）在40个循环之内，HSC组中InfA，swFluA，swH1探针的荧光增长曲线不应该超过阈值线。如果任何其中任何一个流感特异性探针的增长曲线超过了阈值线，那么有以下解释：

（1）可能由于RNA提取试剂污染。在实验前确保RNA提取试剂无误。

（2）RNA提取过程或建立反应加样过程发生交叉污染。严格遵照 *** 作程序的要求进行重复实验。

（3）在40个循环之前，PTC反应的InfA, swInfA, swH1和RP反应应出现阳性结果。如果没产生预期的阳性结果则视为无效，应严格遵照 *** 作程序进行重复实验。确定PTC反应失败原因，订正并记录错误原因及更改方案。不再使用没产生预期结果的PTC试剂。

（4）当所有对照都满足要求后，如果InfA反应增长曲线与阀值线在40个循环内有交叉时，则样本被视为A型流感病毒阳性。如果A型流感病毒反应呈阳性，那么Univ SW 和/或 SW H1也可能呈阳性。如果样本InfA和特异亚型反应（swInfA和swH1）的反正增长曲线与阈值线在40个循环内有交叉，则视该样本为猪流感病毒A/H1阳性。如果样本只有InfA和一个亚型的反应阳性或只有InfA阳性，请联系CDC做进一步指导。

（5）在所有对照都满足要求的前提下，如果在40个循环内，待测样本的所有InfA反应阴性则视该样本为阴性。

8、限制规定

1）实验员在实际 *** 作之前应进行 *** 作程序和试验结果分析的培训，熟练掌握后方可进行试验。

2）当样本量不足可能会产生假阴性结果，造成的原因可能是不当的收集，运输或处理。

3）如果反应中存在过量的DNA / RNA模板时也可能出现假阴性。如果某样本的RP反应被抑制，则可以将提取的RNA进行2倍或更大倍数的稀释（例如1：10或1：100）来重复试验。

9、备注

引物和探针参见英文版P7。

附件4

real-time RT-PCR方法检测鉴定甲型H1N1流感 *** 作规程

（英文版）

附件5

基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒

一、目的

对采集的可疑病例标本进行检测，筛选甲型H1N1流感病毒并排除季节性H1N1流感病毒。

二、引物 NIC引物 引物名称 碱基组成 目的片段大小 备注 FluA FluA-M-F30 TTCTAACCGAGGTCGAAACG 235bp 甲型流感病毒M基因通用检测引物 FluA-M-R264 ACAAAGCGTCTACGCTGCAG H1HA H1 F1147 AAGAGCACACATAATGCCAT 527bp H1N1亚型检测通用引物 H1 R1673 CCATTRGARCACATCCAG HuH1HA H1HA F768 ACTACTGGACTCTGCTGGAAC 327bp 人季节性流感病毒H1N1亚型检测引物 H1HA R1094 CAATGAAACCGGCAATGGCTCC SWH1HA-1 SW-H1 F786 AATAACATTAGAAGCAACTGG 153bp 此次甲型H1N1亚型流感病毒引物 SW-H1 R920 AGGCTGGTGTTTATRGCACC RnaseP RnaseP F AGA TTT GGA CCT GCG AGC G 约80bp 与real-time PCR中RnaseP引物一致 RnaseP R GAG CGG CTG TCT CCA CAA GT 三、材料及仪器

1、 RNA 提取试剂盒QIAGen RNeasy Mini Kit （catalog #74104）

2、β－巯基乙醇（SIGMA β-Mercaptoethanol Lot 062K0115）

3、70%乙醇

4、RT-PCR Kit：QIAGEN One step RT-PCR Kit（catalog #210212）

5、RNasin Ribonuclease Inhibitor （Promega catalog #N2111）

6、检测引物

7、Axygen 15mL离心管，货号：MCT-150-C

8、Axygen 02mL PCR管，货号：PCR-02-C

9、Axygen 10μL，100μL，200μL，1000μL带滤芯q头

10、10μL，100μL，200μL，1000μL加样器

11、可调转速14K离心机：

12、旋涡混合器：

13、生物安全柜：二级生物安全柜

14、PCR仪：

15、琼脂糖：Biowest Agarose Distributed by Gene Tech（Shanghai）Company Limited Lot No 101685

16、核酸染料：

17、电泳液：5×TBE电泳缓冲液 cat No 9009032718．电泳槽、电泳仪

四、实验步骤

（一）RNA提取

1、根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用15mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区 *** 作）。

2、在生物安全柜内将采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）取100μL加入RLT液管中，充分混匀。

3、每管分别加入5μL β-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL 70%的乙醇，充分混匀。

4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记。取步骤（3）中的混合液600μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。

5、滤柱仍放回收集管上，将步骤（3）剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。

6、于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，离心15s。

7、从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，离心15s。

8、弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，离心2min。

9、将滤柱移到一个干净的15mL eppendorf管上，向滤柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室温静置1~3min。

10、12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20℃以下保存。

注意：Buffer RPE使用之间加44mL无水乙醇。

（二）反应体系配制

1、实验设计：

检测标本RNA

质控参数：

阴性对照：无菌水（标本RNA提取时，跟标本同时提取无菌水。）

阳性对照：已知病毒RNA

2、PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液）

1）按下表加入试剂：

PCR反应体系 组 分 体 积（μL） RNase Free Water

5×RT-PCR Buffer 119×n

5×n 10mM dNTP Mixture 1×n Enzyme Mix 1×n RNase Inhibitor 01×n 上游引物 05×n 下游引物 05×n Total 20×n 对每一个建立的反应确定反应数（n=拟进行的PCR管数，包括阴性，阳性对）。考虑到阴性无模板对照，阳性对照，误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：

（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；

（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。

2）将上述反应液混匀，分装到02mL PCR小管中，每管20μL，分别做好标记。

3）加RNA模板（在核酸提取区）

将上述分装好的PCR小管分别加入模板。首先加入阴性对照管（5μL无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。

3、RT-PCR反应

将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR

扩增，反应程序如下： 温度 (C) 时间 循环数 60℃ 1min 1 42℃ 10min 50℃ 30min 95℃ 15min 94℃ 30s 35 52℃ 30s 72℃ 1min 72℃ 7min 1 4℃ 保存 4、RT-PCR产物检测

1）20%琼脂糖凝胶制备：称取20g Agarose，倒入耐热玻璃瓶内，再加入电泳液（1×TBE）100mL，轻轻混匀后加热，使Agarose完全熔化。待Agarose胶温度降至50～60℃左右，加入核酸染料，轻轻混匀（不要产生气泡）。待胶温度降至50℃左右时，将其倒入制胶板，插好电泳梳子。待胶完全凝固（约30～60min）之后，将梳子拔出。

2）将制备好的电泳胶放入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1×TBE）浸过胶面即可。

3）PCR产物各取10μL，加入2μL上样缓冲液（6×Loading Buffer），混匀后加入电泳胶孔内（先加Marker（DL－2000）5μL，然后依次加标本PCR产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。

4）电泳电压100V，约30～40min后看结果。

5）将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相。

5、结果判断

在系统成立，即阴阳性参考均正常的条件下，各引物所代表意义如下： PCR引物 待检样品1 待检样品2 待检样品3 待检样品4 待检样品5 待检样品6 FluA _ + + + + +/- H1HA _ _ + + + +/- HuH1HA _ _ + _ _ +/- SWH1HA-1 _ _ _ + _ +/- RnaseP + + + + + _ 结果判断 非甲型流感病毒 甲型流感病毒

非H1N1亚型 人季节性H1N1亚型流感病毒 猪H1N1亚型流感病毒

送国家流感中心复核 送国家流感中心检测 标本不是人源标本/标本中细胞量少/实验或仪器问题

有的时候乙型流感比较严重就会把人隔离起来，很多人分不清到底是什么程度需要隔离，下面的我为你们介绍乙型流感要隔离吗？乙型流感患病须知。

乙型流感要隔离吗

一般不需要特意隔离，得病的和健康的人适当保持距离就行。

流感病毒一般要经过3到5天的专门检测才能确定，因此上述疑似感染流感的“流感样病例”，医务人员会用无菌棉签在患者咽部的分泌物里取样。同时也开始积极对患者进行治疗，如果患者白细胞不高，听诊无肺部体征，考虑是病毒性感冒或流感的可能性比较大，一般不使用抗生素，而是让患者充分休息、多喝水，同时使用退烧药物或清热解毒的中药。经过治疗，如果患者没有其他并发症出现，一般几天就可痊愈。由于流感病毒传播性强，因此即使是流感样病例，医务人员也提醒患者要注意自我的隔离和家属的防病，以免传染他人。

乙型流感患病须知

在流感高发季节，尽量少去人群拥挤、空气污浊的密闭场所。

注意个人卫生，勤洗手，打喷嚏或咳嗽时，用手帕或纸巾轻掩口鼻。

避免近距离接触流感样病例患者，必须接触时，应配戴口罩。

均衡饮食、适量运动、充足休息、避免过度疲劳。随温度变化，注意增减衣物，以免着凉。

公共场所做好定期消毒与清洁工作，保证必要的通风换气。

若出现流感样症状，应立即停课或离开工作岗位，避免接触他人，同时应及时就医，并配戴口罩。

学校和托幼机构等集体单位，加强晨午检和因病缺勤登记，发热学生应及时离校或离园。

流感小知识

正粘病毒科:一类对粘蛋白具有特殊亲和性的RNA病毒

·分为四属:

甲(A)型流感病毒

15个H和9个N亚型,仅3个H亚型(H1、H2、H3)和2个N亚型(N1、N2)在人间传播。一些低等动物和禽鸟类是自然宿主。

乙(B)型流感病毒

能否感染人以外的其他动物至今不肯定，有报道可以感染海豹。

丙(C)型流感病毒

已证实可以感染猪

丁(D)型流感病毒

(Thogoto病毒)

非洲发现(七条基因)，这个病毒是经由跳蝨传染，会感染牛、羊及人类产生脑膜炎。很少报道

乙型流感注意事项

注意饮食

饮食宜清淡，“三高”饮食会降低人体免疫力，饮食过咸，会使唾液分泌及口腔内的溶菌酶减少，并降低干扰素等抗病因子的分泌，使流感病毒易进入呼吸道黏膜而诱发流感。

还有，吃禽肉等要加热充分，保证煮熟、煮透，煮鸡蛋时蛋壳应用流水清洗，不吃生的鸡蛋等，更不宜食用病禽、死禽等。

注意保暖

注意保暖，外出时如果室外气候寒冷，可以穿些保暖的衣服。特别是脚部的保暖。脚对温度比较敏感，若脚部受凉，会反射性地引起鼻黏膜血管收缩，使人容易受流感病毒侵扰。同时，提倡冷水洗脸。

及时就医

流感的潜伏期一般为1～3天，起病特点为突然发病。其初起症状往往与普通感冒相似，但一些患者可能出现病情突然加重，个别重症患者病情发展迅速，如果未能得到及时、正确的诊治，可能出现严重的并发症甚至导致死亡。早发现、早报告、早诊断、早治疗是防治呼吸道传染病的关键，凡出现发烧、咳嗽、头痛、浑身疼痛等呼吸道感染症状者，尤其是出现高热、呼吸困难者，应及时就医。

第19点即是它的症状

什么是禽流感

禽流感这个名称，对一般人来讲可能有点陌生。因为在过去相当长的一段时间里，人们把它称为鸡瘟，意大利1878年首次报道。1901年证实其病原为滤过性病原体，1955年才证实该病原为甲型流感病毒的一员。后来发现实际上在禽类中还存在一种相似的疾病叫新城疫。两者常常被混为一谈。

为把二者区别开，现把前者称为禽流感或真性鸡瘟、欧洲鸡瘟，把后者称为新城疫或伪鸡瘟、亚洲鸡瘟。所以，禽流感是由甲型流感病毒引起的一种人畜共患的急性传染病。

根据致病力的不同，禽流感病毒可分为高致病性、低致病性和非致病性三大类。高致病性禽流感因传播快、危害大，被世界动物卫生组织列为A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。

2禽流感病毒与流感病毒是什么关系？

我们通常所说的流感，是由甲（A）、乙（B）、丙（C）三型流感病毒引起的一种人类急性呼吸道传染病。甲型和乙型，特别是甲型可引起人类流感大流行，丙型仅引起散在病例。禽流感为甲型流感病毒引起。

甲型流感病毒具有血凝素（H）和神经氨酸酶（N）两种表面抗原，H和N又可进一步细分，H可分为H1～H15，N可分为N1～N9。不同的血凝素和不同的神经氨酸酶会组成一个个具有不同抗原性和致病性的流感病毒，专业术语称之为流感病毒亚型。

甲型流感病毒的亚型有145个，其中能引起人类流感的主要为H1～H3型，且H1N1、H2N2、H3N2曾在人间造成流感大流行。其他多数亚型的自然宿主为禽类、猪、马等多种动物，特别是水禽类，而且所有的H1～H15、N1～N9亚型抗原都可以从动物中分离到。

3什么因素决定流感是否会大流行？

流感病毒的最大特点是抗原变异性，而这种变异性能够引起传播力的变化。其中A型抗原变异性最强，经常发生小的变异，称为“抗原漂移”。流感病毒的变异程度不同，引起流行的程度也不同。当流感病毒发生大的变异或亚型转变时，称为“抗原转移”，这时就可能引起世界性流感大流行。相比较而言，B型变异性较弱，只会引起局部地区的暴发和流行；C型比较稳定，仅引起散发病例。因此A型流感病毒是人类研究和预防控制的重点。

4禽流感病毒抵抗力如何？

禽流感病毒在低温、干燥以及甘油中可保持活力达数月至一年以上。在干燥的尘土中，病毒能活存14天。在较低的温度下，病毒在污染的粪便中存活至少3个月。在水中，22℃时存活长达4天，0℃时可超过30天。在冷冻的禽肉和骨髓中，可存活10个月。禽流感病毒怕阳光、怕热，对普通消毒剂也很敏感。在直射阳光下，40－48小时即可被灭活。通过加热（60℃30分种，100℃1分钟）或普通消毒剂（福尔马林、碘复合物等）即可杀灭病毒。

5为什么说人禽流感是新传染病？

虽然禽流感在禽鸟等动物中已经流行了100多年，但以前一直没有人类感染的报道。1997年，在我国的香港地区，发生了18例人禽流感病例，其中6人死亡。该次暴发的人禽流感，病毒株与当时发生在香港家禽中的禽流感的病毒株一致，均为H5N1型，这是第一次有记录的禽流感感染人类。所以说，禽流感对于人类来说，是一种新发现的传染病。

禽流感的传播特点

6禽流感的传染源是什么？

传染源是指体内有病原体生存、繁殖并能排出病原体的动物和人。禽流感的传染源主要是病禽和带毒禽，包括水禽和飞禽。研究显示，对于高致病性禽流感，1克污染的粪便中病毒的含量就可造成100万只禽感染。目前还不能认为人类是禽流感的传染源。

7禽流感的易感动物有哪些？

对某种传染病具有感染性的动物称为易感动物。鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、雉鸡、鹧鸪、鸵鸟、鸽、孔雀等多种禽类对禽流感均易感。最敏感的为鸡、火鸡，鸭、鹅及其他水禽多为隐性感染。水禽与旱禽同场混养可造成交叉感染，病毒很容易在大规模饲养的鸡群或鸭群中传播。野生与养殖水禽可通过使用共同水体传播。

除了感染禽类，禽流感还可以感染猪。

8禽流感在禽之间如何传播？

禽流感主要通过接触感染的禽及其分泌物、排泄物，污染的饲料、水、蛋托（箱）、垫草、种蛋、鸡胚和精液等媒介，经呼吸道、消化道感染，也可通过气源性媒介传播。

在自然界中，鸟类带毒最为广泛，因此，迁徙面广的候鸟、野鸟、水禽对本病传播起着重要作用。家禽体表的寄生昆虫是否也带毒，能否通过叮咬而感染，目前尚不明了。

9禽流感病毒通过什么途径传播给人类？

禽流感病毒可通过消化道和呼吸道进入人体传染给人。如果直接接触带有相当数量病毒的物品，如家禽的粪便、羽毛、呼吸道分泌物、血液等，也可经过眼结膜和破损皮肤引起感染。

10禽流感的高危人群包括谁？

兽医和长期从事鸡、鸭、鹅、猪等动物饲养、贩运、屠宰的人员。

11人与人之间会传播禽流感吗？

目前只发现经家禽传染给人的病例，还没有发现人与人之间传染的案例。也就是说，人和人之间还没有证据证明是可以互相传染的。不过，WHO警告说，从理论上说，如果病毒变种，就可能出现人与人之间的传播。

12禽流感是如何在局部地区传播的？

禽流感很容易从一个农场传播到另一个农场。禽类的粪便可含有大量病毒，造成灰尘、土壤污染，再通过空气引起禽类之间的传播。病毒通过污染器械、运输工具、饲料、笼、衣服，特别是鞋子，从一个农场带到另一个农场。病毒还可通过动物的脚和身体携带（如啮齿类动物）而传播。活禽在拥挤、卫生状况差的市场进行交易，也是传播的一种途径。目前，苍蝇传播此病毒的能力尚未得到证实。

13禽流感是如何远距离传播的？

通过活家禽的国际贸易，禽流感可从一个国家传播到另一个国家。迁徙鸟类，包括野生水禽、海禽和岸禽类，可长距离携带病毒。野鸭是最引人注目的禽流感病毒的自然宿主，其本身对病毒感染具有较强的抵抗力，有时仅有轻微的、不致命的疾病表现，但它们可长距离携带病毒，并在粪便中排出病毒。人们饲养的鸭、火鸡、鹅及其他用作商业、家养的禽类，会因此造成致命性的感染。家禽的自由流动、与野生鸟类共用水源或者使用一个可能被感染的野生鸟类粪便污染的水源，病毒传播的危险性最大。

14吃煮熟的禽肉、蛋会被传染吗

人类感染禽流感病毒的途径主要是接触感染。禽肉煮熟煮透后，病毒可被杀死，传播的可能性较小，目前尚未发现由于吃禽肉及蛋而受到感染的病例。但如果病禽未经煮熟煮透食用，病毒就可能进入人体。所以如果食用未经检疫或来自疫情暴发区的家禽，则不排除染病风险。

15买活鸡回家吃是否会被传染

如果是健康的活鸡基本是安全的，但如果是病鸡就有危险。WHO警告说，人不管接触什么样的病鸡都同样有危险。少量染病的家禽能幸存下来，但它们至少在10天之内还会排泄含病毒的粪便。另外，鸡的翅膀有可能藏有禽流感病毒，所以，鸡翅膀扑打时可能会造成病毒释放。

16羽绒制品是否传播禽流感？

羽绒制品通常会经过消毒、高温等多个物理和化学处理过程，传播病毒的几率应当很小。

禽流感的临床表现

17禽流感的潜伏期有多长？

潜伏期是指病原体侵入机体到最初症状出现之间的这段时期。禽类禽流感的潜伏期从几小时到数天，最长可达21天。人类患上禽流感后，潜伏期一般在7天以内。

18禽类患禽流感有哪些表现？

禽类感染后发病有两种形式：

低致病性禽流感仅引起轻微的症状，有时仅表现为羽毛皱、乱和产蛋量下降。

高致病性禽流感禽类可突然死亡，且死亡率高，饲料和饮水消耗量及产蛋量急剧下降。病鸡极度沉郁，头部和脸部水肿，伴鸡冠发绀、脚鳞出血、神经紊乱。鸭、鹅等水禽有明显的神经和腹泻症状，可出现角膜炎症，甚至失明。

养殖场一旦发现家禽出现上述症状，即可怀疑为高致病性禽流感。

19人类患禽流感有哪些症状？

人类患上禽流感后，早期症状与重症流感非常相似，表现为高热、流涕、鼻塞、咳嗽、咽痛、头痛、全身不适，部分患者可有恶心、腹痛、腹泻、稀水样便等消化道症状。有些患者可见眼结膜炎等眼部感染，体温大多持续在39℃以上。部分患者胸部X线片会显示单侧或双侧肺炎，少数患者伴胸腔积液。有些病人可发生急性呼吸窘迫症及其他严重威胁生命的综合征。人类患禽流感的病死率高达30％以上。

禽流感的诊断治疗

20禽类感染禽流感如何进行实验室诊断？

采集活禽样品时，可使用泄殖腔拭子和气管拭子取样。采集死禽样品时，应采集气管、脾、肺、肝、肾和脑等组织器官。对小珍禽，应采集新鲜粪便。

实验室检验包括病原学诊断和血清学检验。病原学检验包括病原分离、基因鉴定和毒力测定。血清学诊断主要包括琼脂凝胶免疫扩散试验（不适用于水禽）、血凝抑制试验（H1）等。

21如何确认发生了家禽禽流感？

据农业部2004年1月28日发出的《关于加强高致病性禽流感防治工作的紧急通知》，我国对高致病性禽流感疫情按下列程序确认：

①省级畜牧兽医部门接到疫情报告后，派2名以上禽流感专家到现场进行临床诊断，临床症状明显的，可怀疑为高致病性禽流感疫情。

②对怀疑为高致病性禽流感疫情的，及时采集标本送省级实验室进行血清学检测，诊断结果为阳性的，可确定为高致病性禽流感疑似病例。

③对疑似病例须派专人将标本送国家禽流感参考实验室做进一步鉴定，标本不得邮寄。

4国家禽流感参考实验室对各省、自治区、直辖市送检的病料进行病原分离和鉴定，并将结论报农业部。

22人类禽流感的诊断依据是什么？

人类禽流感的诊断原则是根据流行病学、临床症状和实验室检查等手段，综合分析，予以诊断。参照于恩庶主编的《新发现和再肆虐传染病诊断标准和防治指南》，诊断依据如下：

①流行病学史禽流感发生在前，即某地区某禽类（鸡、鸭、鹅等）养殖场大批禽出现禽流感样症状，并死亡；附近或周边地区出现禽流感流行或暴发。

②临床表现突然起病，发热（大于38℃）、咳嗽、咽痛，可出现头痛、头晕、全身酸痛、乏力等中毒症状，可伴有干咳、流鼻涕、流泪等呼吸道症状。少数病例有食欲减退，伴有腹痛、腹胀、呕吐等消化道症状。

③实验室检查从病人鼻咽或气管分泌物中分离到流感病毒；患者恢复期血清中抗流感病毒抗体滴度比急性期高4倍以上；在患者呼吸道上皮细胞查到流感病毒颗粒特异的蛋白成份或特异的核酸；采集标本经敏感细胞将病毒增殖一代后，查到流感病毒颗粒特异的蛋白或特异的核酸。

4病例分类我国目前还没有统一的人类禽流感病例分类标准，国家卫生部正在组织制定。

23禽类感染禽流感后需要治疗吗？

目前对禽流感尚无可靠的治疗方法。禽类感染禽流感后，对病禽必须彻底扑杀，以防止疫情扩散。

24人感染禽流感后如何治疗？

①一般治疗按呼吸道隔离1周或至主要症状消失。病人需卧床休息，多饮水，适宜的营养，补充多种维生素，保持鼻咽及口腔清洁。症状重者应住院治疗。在出现细菌性并发症时，才使用抗生素。

②对症治疗有高热及头痛者，可用物理降温或给予解热镇静剂，小儿禁用阿司匹林。对高热、呕吐者应予以静脉补液。对咳嗽、咯痰者，可服用止咳、祛痰药。

③服用抗流感病毒药物金刚烷胺和金刚乙胺为病毒M2蛋白抑制物，对甲型流感有效，其作用是阻断病毒吸附于敏感细胞。通常发病48小时内开始用药，可使病毒排出量减少，排毒时间缩短，临床症状减轻，一两天即可退热，并可预防感染向下呼吸道蔓延，减少肺炎发生。扎那米尔（Za－nimivir）和奥司托维尔（Oseltamivir）是神经氨酸酶抑制物，能够抗甲、乙型流感病毒。

25人得了禽流感可以治好吗？

大多数患者经及时治疗后均可治愈。此病病程短，恢复快，且不留后遗症。少数患者，特别是年龄较大、治疗过迟的患者，病情会迅速发展，病人可因进行性肺炎、急性呼吸窘迫综合征、肺出血、胸腔积液、全血细胞减少、肾衰竭、败血症、休克等多种并发症而死亡。所以，病人一旦出现以上症状，应及时就医。一旦被怀疑为H5N1病毒感染，应马上住院隔离治疗，并报告疫情，防止病情恶化和传染扩散。

冬季流感高发期应对措施，入冬至今，全球多地出现流感高发现象。国家卫计委监测发现，近期我国南方和北方，都已经进入了流感冬季高峯季节。流感病毒来势汹汹，并且已经在多地集中爆发，所以大家千万不能大意。用科学方法来应对这场“流感大作战”。下面就给大家介绍冬季流感预防的科学方法。

接种流感疫苗

流感疫苗可以有效的预防流行性感冒，是控制流感的主要措施之一。在我国，接种流感疫苗的时间一般为每年的9——11月份，因为冬季是流感的多发季节，在流感大范围爆发之前接种疫苗，可以最大限度的帮助接种疫苗者做好防护。

注意个人卫生

勤洗手——使用肥皂/洗手液，并用流动水洗手，能防止细菌、病毒的传播和感染，尤其是去过公共场所等人羣密集的环境或双手接触呼吸道分泌物后，应立即洗手。

此外，在打喷嚏或咳嗽时也应用手帕或纸巾掩住口鼻，避免飞沫感染他人。

注意开窗通风

一进入冬季，气温变冷，大家就开始对开窗通风格外牴触。尤其是近年来雾霾频发，愿意开窗的人就更是少之又少，殊不知，正是这些因素，才给病毒的传播创造了绝佳的条件。

增强抵抗力

抵抗力好了，疾病自然就不容易找上门了。加强体育锻炼、保持充足睡眠都是我们熟知的增强抵抗力的好方法，但是很多人却忽视了，抵抗力还可以通过“吃”来补充。

比如洋葱和大蒜，就具有强效的杀菌消毒功效，可以帮助人体预防流感；白萝卜含有大量的有机硫磺化合物和丰富的维生素c、微量元素锌，能提升人体的抗寒能力。

冬季流感高发期应对措施，入冬至今，全球多地出现流感高发现象。国家卫计委监测发现，近期我国南方和北方，都已经进入了流感冬季高峯季节。流感病毒来势汹汹，并且已经在多地集中爆发，所以大家千万不能大意。用科学方法来应对这场“流感大作战”。下面就给大家介绍冬季流感预防的科学方法。

穿衣适度

冬天的穿衣也是一门讲究，过多过少都不好。首先，我们都知道，在大冷天穿衣过少会很容易着凉受寒，让感冒有可乘之机。

但穿太多太厚又会经常出汗，出汗后风一吹反而更容易着凉。所以，穿着适量，并随身带着一件外套，根据环境和场合适当加减是最好的办法。

病毒在外界的生存能力很差，它们怕阳光中的紫外线、怕洁净、怕干燥，在新鲜的空气中病毒会很快丧命。所以学校或居家环境中经常开窗通风，能够很大程度上降低流感传染的风险。

当然，增强抵抗力最重要的还是要均衡饮食、加强锻炼、避免过度疲劳，而多喝水也是一种很不错的保健方法。

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