单细胞测序 rna-seq 哪个更准

单细胞测序和RNA-seq是应用在不同研究中的两种测序类型，只看适不适合，没有那个更准的问题，单细胞测序主要应用在细胞分化、发生、发展、演化过程中的突变等，如癌症的组织差异性，干细胞的分化、细胞重编程及转分化等过程及相关的基因调节网络等，单细胞测序也有全基因组测序和转录组测序两种；RNA-seq主要用于组织或器官等RNA的表达情况，如功能基因的表达上调及下调分析，转录因子的表达水平等。

第一部分详见： NGS015 单细胞测序（上）

基于GemCode技术的Chromium系统在几分钟内将样品包裹到数百到数万个单独的且可追溯的微滴 中，每个微滴都包含一个可识别的条形码标签序列，便于下游分析。 将数以百万计的、带有寡核苷酸条形码标签的凝胶珠（Gel Bead） 与样品混合——样品可以是高分子量（HMW）DNA、单细胞、经Feature Barcoding技术标记的细胞、细胞核、经转座酶处理的细胞核或细胞珠 （Cell Beads）。随后将凝胶珠和样品加入油-表面活性剂 溶液中，以产生GEM（Gel Beads in EMulsion），GEM作为单独的反应囊泡，凝胶珠在其中溶解，样品在其中被加上标签。将带有标签的 产物混合，进行下游反应，从而产生与短读长测序仪兼容的文库。测序 后，将带有标签的短读长序列交给交钥匙分析软件的分析流程，软件可 利用标签将序列定位到最初的高分子量DNA、单细胞或单细胞核。

DNBelab C系列单细胞文库制备技术

DNB纳米球测序技术

361 SMARTer® ICELL8® Single-Cell System

CELL8 cx Single-Cell System是一款先进的集成自动化平台，它将成像功能与分注功能进行组合，可直接完成5,184-纳米孔芯片分离单细胞的全过程。该系统装配了大口径分配器，可以完成无细胞大小偏好的单细胞分离。成像功能可以对单细胞与多细胞进行区分。此外，通过使用荧光技术并结合细胞染料，还可以完成对活细胞/死细胞的分析

利用微流体芯片技术，自动完成最多 800 个单细胞的捕获、裂解、逆转录、 预扩增和产物回收
专门制备单细胞核酸样本的自动化系统，速度快、成本低，数据重复性好、可信度高
适用于 BioMark HD 系统的基因表达分 析和 NGS 的转录组分析及 DNA 分析
提供与细胞大小相适合的 IFC（Integrated Fluidic Circuit）芯片

实验技术重难点

随着单细胞测序技术的突破，单细胞测序的时代已然到来。2018年单细胞基因组学被science评为年度突破技术，2020年单细胞多组学技术被Nature Methods 评为2020年年度技术。
其中10xGenomics作为单细胞测序方向上的佼佼者，持续致力于单细胞测序技术和新应用的开发，推动这单细胞测序时代的快速发展。目前应用其技术已经发表了2200+的文章，国内达230+的文章，其中大多数集中在人和动物方面，近年来，其在植物方向上的应用也在逐步扩大，涉及的物种包括拟南芥、水稻，以及玉米，本文就带大家一起看一下2021年1月4日由美国冷泉港实验室发表的有关玉米穗单细胞的文章。

作物生产力取决于分生组织的活动能力。分生组织发育成植物的组织，包括玉米穗的结构。全面了解植物的发育过程需要洞察细胞类型和发育区域的多样性以及它们所需的特定的基因网络。到目前为止，这些发育的过程主要是通过形态学和传统遗传学的知识来鉴定的，而传统遗传学又受限于遗传转录的冗余和多样性。

文章研究了12525个来自玉米穗发育的单个细胞的转录谱。由此产生的发育图谱提供了花序的单细胞RNA测序（scRNA-seq）图谱。并通过mRNA原位杂交和荧光活化细胞分类（FACS）RNA序列验证了我们的结果，并通过预测遗传冗余、整合转录网络和鉴定与作物产量性状相关的候选基因，进一步展示了这些数据如何促进遗传研究。

文章概览如下：

植物植株是由多能干细胞及其后代发育的分生组织发育而来的。分生组织能够分化为不同的细胞类型和具有特定功能的结构。在玉米穗发育过程中，部分分生组织形成花序结构。

突变体研究已经确定了关键的细胞类型或结构特异性调控因子，通过突变不同的发育结构域来调整花序结构的发育（Vollbrecht &Schmidt，2009）。例如，KNOTTED1（KN1）编码的同源域转录因子对分生组织的建立和维持至关重要，并且在整个茎分生组织中表达（Jackson等人，1994）。通过对KN1的突变来研究其在分化过程中的作用。在进化或驯化过程中，许多关键的调控因子调控花序的结构的发育，这些调控因子的发现是因为基因突变体的存在而得以实现的，同时这些突变体阻碍了的细胞在某些特定方向上的发育。然而，这些理论都受到遗传转录冗余性和多样性的限制，因此需要一个特定细胞类型和结构分布的高分辨率表达图谱来进一步了解控制发育的基因网络。

单细胞RNA测序（scRNA-seq）提供了高分辨率分析基因表达和构建复杂器官或生物体发育图谱的机会。最近，10x Genomics scRNA-seq平台已被广泛用于鉴定拟南芥根中的细胞类型或结构域标记（Rich Griffinetal，2020），但该技术在茎组织中的应用还受到限制。单细胞测序的数据可以结合CHIP-seq的对转录因子的鉴定或者survey对染色体状态的研究，以得到更完善的基因表达的信息。

文章利用10xGenomics scRNA-seq技术优化了一个方案，生成了玉米穗花序发育的高分辨率转录组图谱，进一步构建了转录调控网络，并确立与玉米穗产量性状相关的候选基因。

植物的单细胞图谱构建的两大挑战，其中之一就是原生质体的制备，文章采用5-10mm阶段的玉米穗，这个阶段决定了整个穗的发育，包括分生组织的起始，维持和终止以及器官发育的规格等。作者优化了细胞壁消化的方法，考虑到 不同细胞组成的差异，消化时间使用的45min。然而在制备原生质体的过程中，通过过滤去除破碎细胞中的小碎片和细胞器，然后通过流式细胞仪进入10xGenomoics系统制备文库，然后利用Illumina平台测序，分析了来自三个独立重复的12525个单细胞，检测了28899个基因的表达， 与普通转录组的基因表达检测情况相当。使用MetaNeighbor进行细胞聚类，共将其聚成12个类别。

构建植物单细胞图谱的另一个重要挑战就是细胞类别的注释和鉴定。为了鉴定每个聚类的差异性，作者编制了一份已知或预测的花序发育标记基因的列表，这些基因的表达模式已经在以往的玉米或拟南芥相关研究中进行了证实，其中74个基因在玉米中都有突变表型，本次检测中检测出了73个基因的表达，并且每个基因在12个类别中1个或者多个中表达量丰富。例如为了鉴定分生组织细胞类型，使用KN1基因，其在整个分生组织以及正在发育的茎和管道组织中表达，但并不在表皮和侧器官中表达。正如预期，KN1在12个类别中的10个中高表达，其他特征基因的表达情况也在下图中可以展示。玉米穗分生组织的纵切面和横切面也分别展示在下图的G和H中，其也显示了与scRNA的细胞聚类情况一致。

下图A绘制每个聚类中top2的marker基因的表达情况，其中颜色表示表达量的Z_score值，圆点大小表示细胞表达的百分数。进一步作者对关键的marker基因进行mRNA的原位杂交，颜色深浅表示基因的表达量情况。Marker基因的在组织中的表达情况与scRNAseq的结果相一致。

通过基因敲除的方式可以来研究某个基因在转录调控网络中的作用。从2个月大的茎尖（左下图，比例尺=100 mm）和6个月大的没有穗或流苏的植株可以看出，CRISPR-Cas9在ZmVOZ基因中敲除4个突变的玉米植株未能过渡到开花。

转录因子（TF）的直接调控靶点在相同的细胞类型中共同表达，使用scRNA-seq数据来计算KN1与其公布的直接调控的靶点的共表达，发现与所有玉米基因的对照相比，其显著高于预期。KN1直接调控的转录靶点在单细胞表达水平上与KN1显著共表达，支持原来的假设。KN1在除了表皮和侧器官中表达量均较高，而通过scRNA的数据发现ZmHDZIV8在3，6这两个聚类中大量表达，同时侧器官中的Marker基因ZmYAB4在聚类3中表达，因此明确了两个细胞类别。为了验证，接下来作者整合了两个额外的ChIP-seq数据集，用于ZmHOMEODOMAIN亮氨酸拉链IV6（ZmHDZIV6）（Javelle 等人，2011年）和ZmMADS16（ZmM16）（Bartlett等人，2015年）在特定花器官中表达。对于每一个TF在 Chip-seq的生物学重复中均有显著重叠，作者确定了ZMMADZIV6和ZmM16的907个高置信度峰，并对这两个基因的motif进行进一步的研究。

mHDZIV6候选调控靶点ZmNIP1A（G）和ZmPROPEP1（J）在scRNA序列中与ZmHDZIV6高度共表达。

玉米穗形态与产量性状相关。为了研究在单细胞转录组中鉴定的细胞聚类和标记基因是否与玉米产量的候选调控因子一致。通过GWAS的方法，比较分生组织、侧器官和微管组织的scRNA-seq的Marker基因与281个玉米穗部与产量相关的形态性状的GWAS的结果结合。利用scRNA-seq的Marker基因2kb内的单核苷酸多态性，作者发现meta cluster 3标记基因ZmYABBY9（ZmYAB9）在CW（穗轴重量上）显著。图A中展示了玉米的相关产量的性状。同时还发现两个显著的单核苷酸多态性（10%FDR）与穗直径（ED）相关。

总之，scRNA-seq为玉米穗发育的研究做出了重要贡献。该图谱可为发育遗传学研究和育种提供基础，文章开发的原生质体的制备方法和分析的方法可应用于其他复杂地上部系统的研究。随着越来越多的植物scRNA-seq数据集的产生，一个跨物种（例如，玉米和拟南芥之间）或跨组织（例如，茎和根）在单细胞分辨率下的比较分析将告诉我们在进化过程中如何选择基因特征，以形成对增殖增产和农业生产至关重要的各种形态。

单细胞核转录组测序（Single Nuclei RNA Sequencing，snRNA-seq）：通过提取样本单细胞核，然后分离、标记细胞核，在单细胞水平研究核基因表达检测的技术。为脑组织、心脏、肾脏等复杂组织或一些珍稀 冻存样品 提供了单细胞水平研究应用平台，可挖掘更多潜在的致病细胞类型，更易于探讨肿瘤细胞异质性和致病机理。

单细胞悬液制备过程往往是造成实验可变性的主要因素。如何获得足质足量的单细胞悬液？这是实验面临的第一个难题，特别是那些稀有细胞或难以解离的细胞；细胞核膜相比细胞膜更为坚固，因此，冻存组织细胞膜破裂后细胞核则能够保持完整，由于仅涉及机械破碎和简单的纯化，snRNA-seq *** 作步骤相对简化，便于开展实验，其稳定性相比scRNA-seq大大提高。

单细胞核测序snRNA-seq由于是抽提细胞核进行测序，所以可以应用于冻存的样本，极大的利用了那些生理病理数据清晰的冻存样本；对于那些新鲜样本解离成功率低的样本；或者是样本的收集难度大，收集周期长，比如一个样本不同阶段的评估，或者根据治疗结果决定前端样本是否入组等情况；亦或是细胞体积大，形状不规则的样本都可以用snRNA-seq来解决。

因为组织可以直接从冻存状态开始抽核，此状态下细胞转录活动已经被抑制并固定，因此不会再发生转录状态改变，结果真实性提高。

直接对细胞进行机械法或者化学法破碎，不会引入解离偏好性，理论上来讲所有细胞类型都能得到回收，能够获得更加完整和全面的细胞图谱。

虽然有一些比较单细胞RNA测序（scRNA-seq）和单细胞核（snRNA-seq）测序的研究表明，转录本在整个细胞和细胞核中的表达程度相当；理论上来讲，缺失了细胞质中的RNA分子，snRNA-seq在鉴定细胞转录状态中可能不如scRNA-seq，同时由于细胞核中带有polyA尾的成熟mRNA比例更低，因此对于某些样本而言，采用snRNA-seq每个细胞核中检测到的基因可能会有偏少的风险，不利于细胞亚型的鉴定。

虽然snRNA-seq能够获得更加全面完整的细胞类型，但是对于某些细胞类型的获得比例不如scRNA-seq，主要表现为免疫细胞。

Slyper, M, Porter, CBM, Ashenberg, O et al A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors Nat Med 26, 792–802 (2020) >