为什么要有m rna反转录成dna

RNA是单连的,单独复制时没有检查程序,变DNA不但可以检查还可以加速复制,还有一点,就是在有DNA的细胞中 RNA无法复制RNA,只有 DNA可以生产RNA

RNA自我复制只能自带酶 很麻烦,还慢,所以绕个弯

1、PCR引物设计

PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上的一小段DNA序列相同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

引物设计的基本原则：引物长度：15-30bp，常用为20bp左右。引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照。

引物内部不应出现互补序列。两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

引物3′端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。引物的5′端可以修饰。如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

2、模板的制备

PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

（一） Sanger双脱氧链终止法（酶法）测序程序 *** 作程序是按DNA复制和RNA反转录的原理设计的。

1分离待测核酸模板，模板可以是DNA，也可以是RNA，可以是双链，也可以是单链。

2在4只试管中加入适当的引物、模板、4种dNTP（包括放射性标记的ddNTP，例如32P ddNTP和DNA聚合酶（如以RNA为模板，则用反转录酶），再在上述4只管中分别加入一种一定浓度的ddNTP（双脱氧核苷酸）。

3与单链模板（如以双链作模板，要作变性处理）结合的引物，在DNA聚合酶作用下从5’端向3’端进行延伸反应，32P随着引物延长掺入到新合成链中。当ddNTP掺入时，由于它在3’位置没有羟基，故不与下一个dNTP结合，从而使链延伸终止。ddNTP在不同位置掺入，因而产生一系列不同长度的新的DNA链。

4用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳同时分离4只反应管中的反应产物，由于每一反应管中只加一种ddNTP（如ddATP），则该管中各种长度的DNA都终止于该种碱基（如A）处。所以凝胶电泳中该泳道不同带的DNA 3’ 末端都为同一种双脱氧碱基。

5放射自显影。根据四泳道的编号和每个泳道中DNA带的位置直接从自显影图谱上读出与模板链互补的新链序列。

探索验证与发育相关的基因，比方说，控制开花的基因我们假设是一个。

1、用某种方法把它敲除，即基因敲除，植物不开花了，那我们就可以说，这是控制开花的基因；

2、用反义RNA进行抑制，基因不表达了，也可以确定；

3、把这个基因克隆出来，转到另外一种生物上面，这种转基因生物能开花了，呵呵，就可以验证了。

很简单吧？其实很难，确定一个基因要好多年。。。

不可以，建议不要隔天做。

反转录得到的cDNA用途广泛，经后续实验可用于检测细胞/组织中基因表达水平，分析细胞中RNA病毒的含量，合成cDNA探针，直接克隆特定基因的cDNA序列，构建cDNA文库等研究。

对于反转录实验，反转录酶的选择至关重要，热稳定性高、聚合能力强、灵敏度高、特异性高的反转录酶将会使反转录实验事半功倍。

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