求助，flash column chromatography和HPLC是不是一回事

Rapid and sensitive step gradient assays of glutamate, glycine,

taurine and g-aminobutyric acid by high-performance liquid

chromatography–fluorescence detection with o-phthalaldehyde–

mercaptoethanol derivatization with an emphasis on microdialysis

samples

T Petteri Piepponena ,, Arnis Skujinsa,b

aDepartment of Pharmacy, Division of Pharmacology and Toxicology, PO Box 56, University of Helsinki, FIN-00014 Helsinki,

Finland

bLaboratory of Pharmacology, Latvian Institute of Organic Synthesis, 21 Aizkraukles Street, Riga LV-1006, Latvia

Received 30 November 2000; received in revised form 26 February 2001; accepted 1 March 2001

Abstract

We developed a rapid step-gradient HPLC method for determination of glutamate, glycine and taurine, and a separate

method for determination of g-aminobutyric acid (GABA) in striatal microdialysates The amino acids were pre-column

derivatized with o-phthalaldehyde–2-mercaptoethanol by using an automated refrigerated autoinjector Separation of the

amino acids was established with a non-porous ODS-II HPLC column, late-eluting substances were washed out with a

one-step low-pressure gradient Concentrations of the amino acids were determined with a fixed-wavelength fluorescence

detector The detection limit for GABA was 80 fmol in a 15 ml sample, detection limits for glutamate, glycine and taurine

were not determined because their concentrations in striatal perfusates were far above their detection limits Total analysis

time was less than 12 min, including the wash-out step The methods described are relatively simple, sensitive, inexpensive,

and fast enough to keep up with the microdialysis sampling ó 2001 Elsevier Science BV All rights reserved

Keywords: Derivatization, LC; Glutamate; Glycine; Taurine; g-Aminobutyric acid

色谱图 chromatogram 色谱峰 chromatographic peak峰底 peak base峰高 h，peak height峰宽 W，peak width半高峰宽 Wh/2，peak width at half height峰面积 A，peak area拖尾峰 tailing area前伸峰 leading area假峰 ghost peak畸峰 distorted peak反峰 negative peak拐点 inflection point原点 origin斑点 spot区带 zone复班 multiple spot区带脱尾 zone tailing基线 base line基线漂移 baseline drift基线噪声 N，baseline noise统计矩 moment一阶原点矩 γ1，first origin moment二阶中心矩 μ2，second central moment三阶中心矩 μ3，third central moment液相色谱法 liquid chromatography，LC液液色谱法 liquid liquid chromatography，LLC液固色谱法 liquid solid chromatography，LSC正相液相色谱法 normal phase liquidchromatography反相液相色谱法 reversed phase liquidchromatography，RPLC柱液相色谱法 liquid column chromatography高效液相色谱法 high performance liquidchromatography，HPLC尺寸排除色谱法 size exclusion chromatography，SEC凝胶过滤色谱法 gel filtration chromatography凝胶渗透色谱法 gel permeation chromatography，GPC亲和色谱法 affinity chromatography

离子交换色谱法 ion exchange chromatography，IEC离子色谱法 ion chromatography离子抑制色谱法 ion suppression chromatography离子对色谱法 ion pair chromatography疏水作用色谱法 hydrophobic interactionchromatography制备液相色谱法 preparative liquid chromatography平面色谱法 planar chromatography纸色谱法 paper chromatography薄层色谱法 thin layer chromatography，TLC高效薄层色谱法 high performance thin layerchromatography，HPTLC浸渍薄层色谱法 impregnated thin layerchromatography凝胶薄层色谱法 gel thin layer chromatography离子交换薄层色谱法 ion exchange thin layerchromatography制备薄层色谱法 preparative thin layerchromatography薄层棒色谱法 thin layer rod chromatography液相色谱仪 liquid chromatograph制备液相色谱仪 preparative liquid chromatograph凝胶渗透色谱仪 gel permeation chromatograph涂布器 spreader点样器 sample applicator色谱柱 chromatographic column棒状色谱柱 monolith column monolith column微粒柱 microparticle column填充毛细管柱 packed capillary column空心柱 open tubular column微径柱 microbore column混合柱 mixed column组合柱 coupled column预柱 precolumn保护柱 guard column预饱和柱 presaturation column浓缩柱 concentrating column抑制柱 suppression column薄层板 thin layer plate浓缩区薄层板 concentrating thin layer plate荧光薄层板 fluorescence thin layer plate反相薄层板 reversed phase thin layer plate梯度薄层板 gradient thin layer plate烧结板 sintered plate

展开室 development chamber 往复泵 reciprocating pump注射泵 syringe pump气动泵 pneumatic pump蠕动泵 peristaltic pump检测器 detector微分检测器 differential detector积分检测器 integral detector总体性能检测器 bulk property detector溶质性能检测器 solute property detector(示差)折光率检测器 [differential] refractive indexdetector荧光检测器 fluorescence detector紫外可见光检测器 ultraviolet visible detector电化学检测器 electrochemical detector蒸发(激光)光散射检测器 [laser] light scatteringdetector光密度计 densitometer薄层扫描仪 thin layer scanner柱后反应器 post-column reactor体积标记器 volume marker记录器 recorder积分仪 integrator馏分收集器 fraction collector工作站 work station固定相 stationary phase固定液 stationary liquid载体 support柱填充剂 column packing化学键合相填充剂 chemically bonded phasepacking薄壳型填充剂 pellicular packing多孔型填充剂 porous packing吸附剂 adsorbent离子交换剂 ion exchanger基体 matrix载板 support plate粘合剂 binder流动相 mobile phase洗脱(淋洗)剂 eluant，eluent展开剂 developer等水容剂 isohydric solvent改性剂 modifier显色剂 color [developing] agent

死时间 t0，dead time保留时间 tR，retention time调整保留时间 t'R，adjusted retention time死体积 V0，dead volume保留体积 vR，retention volume调整保留体积 v'R，adjusted retention volume柱外体积 Vext，extra-column volune粒间体积 V0，interstitial volume(多孔填充剂的)孔体积 VP，pore volume of porouspacking液相总体积 Vtol，total liquid volume洗脱体积 ve，elution volume流体力学体积 vh，hydrodynamic volume相对保留值 ris，relative retention value分离因子 α，separation factor流动相迁移距离 dm，mobile phase migrationdistance流动相前沿 mobile phase front溶质迁移距离 ds，solute migration distance比移值 Rf，Rf value高比移值 hRf，high Rf value相对比移值 Ris，relative Rf value保留常数值 Rm，Rm value板效能 plate efficiency折合板高 hr，reduced plate height分离度 R，resolution液相载荷量 liquid phase loading离子交换容量 ion exchange capacity负载容量 loading capacity渗透极限 permeability limit排除极限 Vh，max，exclusion limit拖尾因子 T，tailing factor柱外效应 extra-column effect管壁效应 wall effect间隔臂效应 spacer arm effect边缘效应 edge effect斑点定位法 localization of spot放射自显影法 autoradiography原位定量 in situ quantitation生物自显影法 bioautography归一法 normalization method内标法 internal standard method外标法 external standard method叠加法 addition method

普适校准(曲线、函数) calibration function or curve谱带扩展(加宽) band broadening(分离作用的)校准函数或校准曲线 universalcalibration function or curve [of separation]加宽校正 broadening correction加宽校正因子 broadening correction factor溶剂强度参数 ε0，solvent strength parameter洗脱序列 eluotropic series洗脱(淋洗) elution等度洗脱 gradient elution梯度洗脱 gradient elution(再)循环洗脱 recycling elution线性溶剂强度洗脱 linear solvent strength gradient程序溶剂 programmed solvent程序压力 programmed pressure程序流速 programmed flow展开 development上行展开 ascending development下行展开 descending development双向展开 two dimensional development环形展开 circular development离心展开 centrifugal development向心展开 centripetal development径向展开 radial development多次展开 multiple development分步展开 stepwise development连续展开 continuous development梯度展开 gradient development匀浆填充 slurry packing停流进样 stop-flow injection阀进样 valve injection柱上富集 on-column enrichment流出液 eluate柱上检测 on-column detection柱寿命 column life柱流失 column bleeding显谱 visualization活化 activation反冲 back flushing脱气 degassing沟流 channeling过载 overloading

扮

DNA测序技术

DNA sequencing technology

在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。目前用于测序的技术主要有Sanger等（1977）发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和 Gilbert（1977）发明的化学降解法。这二种方法在原理上差异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，产生 A，T，C，G四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得DNA序列。目前Sanger测序法得到了广泛的应用。

Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸 (dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、 A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X- 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

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一、概述：

Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。 此外, SILVER SEQUENCETM系统用未修饰的5'OH寡聚核苷酸作为引物，减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎 *** 作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。

Taq DNA聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA聚合酶是一种Taq DNA聚合酶的修饰产品，对于双链DNA模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。

SILVER SEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。

退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物(<500bp)得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。一般来说，较长的引物及GC含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明，>24mer的GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。

由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处：(1)本方法线性扩增模板DNA产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要003-- 2pmol模板DNA, 随模板种类而定。(2) 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA(dsDNA)模板的碱变性及乙醇沉淀过程，变性循环也有助于消除由于线性dsDNA模板(如PCR反应产物)快速重退火所引起的问题。(3) 高温聚合酶反应减弱了DNA模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。

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二、材料

待测已提纯的DNA，可为单链，也可为双链。

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三、设备

高压电泳仪，测序用电泳槽，制胶设备，PCR仪。

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四、试剂

（1）SILVER SEQUENCETM DNA测序试剂盒。

（2）丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉双丙烯酰胺 W/V)：95g丙烯酰胺，5g甲叉双丙烯酰胺溶于140ml 双蒸水中，定容至250ml，045mm过滤器过滤后，贮于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。

（3）10%过硫酸铵，05g过硫酸铵溶于4ml水中，定容至5ml，应新配新用。

（4）10×TBE缓冲液（1 mol/L Tris, 083mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA)： 1211g Tris，5135g硼酸，372g Na2 EDTA ·2H2O，溶于双蒸水中定容至1升，置于4℃下可贮存2周，其pH约为83。

（5）TBE电极缓冲液：10×TBE 缓冲液稀释至1×TBE备用。

（6）TEMED

（7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2升备用。

（8）染色溶液：硝酸银2克，甲醛3ml，溶于2升超纯水中备用。

（9）显影溶液：60克碳酸钠（Na2CO3)溶于2升超纯水中，使用前加3ml 37% 甲醛和 40ml硫代硫酸钠溶液（10mg/ml)。

（10）95%乙醇。

（11）05%冰乙酸。

（12）Sigmacote (Sigma CAT #SL-2)。

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五、 *** 作步骤

：

成功地使用银染测序系统需要对提供的 *** 作方法进行仔细考虑。银染不如放射性检测法灵敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通过延长X-光胶片曝光时间的方法增加信号强度。因此，请使用推荐的DNA模板量, 每次均使用所提供的对照检查系统的可靠性，并且注意如下几点：

（1） DNA的浓度和纯度必须经过琼脂糖凝胶电泳或荧光法测定, 样品应与已知量DNA一起电泳。

（2） 分光光度法对于很多DNA提取物包括质粒小量制备来说，并不能给出一个可信的DNA浓度估计，混杂的染色体DNA、蛋白、RNA、有机物及无机化合物均可能有260 nm光吸收。因此，分光光度法常常错误地高估DNA浓度。

（3） DNA制备过程中用核糖核酸酶处理所产生核糖核苷酸，虽然它们在电泳后DNA样品的前面，并不能观察到，但它们仍会有260nm光吸收。

（一）测序反应：

1 对于每组测序反应，标记四个05ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20ml)矿物油，盖上盖子保存于冰上或4℃备用。

2 对于每组四个测序反应,在一个eppendorf管中混合以下试剂：

（1） 样品反应：

质粒模板DNA 21pmol

5×测序缓冲液 5ml

引物 45pmol

无菌ddH2O 至终体积16ml

（2）对照反应

pGEM-3Zf(+)对照DNA(4mg) 40ml

5×测序缓冲液 5ml

pUC/M13正向引物(45pmol) 36ml

无菌ddH2 O 至终体积 16 ml

3 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入10ml测序级Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸动几次混匀。

4 从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。

5 在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。

6 把反应管放入预热至95℃的热循环仪，以[注意]中循环模式为基准，开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350碱基的长度。

7 热循环程序完成后，在每个小管内加入3μl DNA测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。

[注意] 1、测序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：

模板种类/长度 模板量

200bp (PCR产物) 16ng(120fmol)

3000-5000bp（超螺旋质粒DNA) 4mg (2pmol)

48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol)

由于超螺旋质粒产生的信号比松弛的线性双链DNA弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。

2、计算与45pmol相当的引物纳克数可用以下一般公式：

45pmol=15ng×n,其中n为引物碱基数

计算与1pmol相当的引物微克数可用以下一般公式：

dsDNA:1pmol=(66×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基对数

ssDNA:1pmol=(33×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基数

3、为阻止Taq DNA聚合酶延伸非特异性退火引物， 热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式，建议从模式1开始。

模式1：适用于引物<24碱基或GC含量<50%

95℃ 2分钟。然后： 95℃ 30秒(变性), 42℃ 30秒(退火), 70℃ 1分钟(延伸)。

模式2:适用于≥24碱基或略短的GC含量≥50%的引物。

95℃ 2分钟, 然后: 95℃ 30秒(变性), 70℃ 30秒(退火/延伸)。 4 在加入终止溶液之后样品可在4℃保存过夜。

（二）、 测序凝胶板的制备

1、玻璃板的处理：

银染测序的玻璃板一定要非常清洁，一般先用温水和去污剂洗涤，再用去离子水冲洗玻璃板，除去残留的去污剂，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高(棕色)。短玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上。这一步对于在银染 *** 作过程中防止凝胶撕裂至关重要。

（1）短玻璃板的处理

A 在1ml 95%乙醇, 05%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鲜的粘合溶液。

B 用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板, 整个板面都必须擦拭。

C 4-5分钟后, 用95%乙醇单向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次这一清洗过程, 每次均须换用干净的纸, 除去多余的粘合溶液。

[注意] 1 在95%乙醇单向擦玻璃板时过度用力会带走过多的粘合硅烷, 使凝胶不能很好地粘附。

2 准备长玻璃板之前要更换手套，防止粘染粘合硅烷。

3、防止粘合溶液沾染在长玻璃板上是很重要的, 否则将导致凝胶撕裂。

(2)、长玻璃板的处理

A 用浸透Sigmacote溶液的棉纸擦拭清洗过的长玻璃板。

B 5-10分钟后用吸水棉纸擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。

[注意] 1 用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板须用去污剂完全清洗。或者凝胶用10% NaOH浸泡后除去。为防止交叉污染, 用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具分开, 如果出现交叉污染, 以后制备的凝胶可能撕裂或变得松弛。

2、凝胶的制备：

（1）玻璃板经粘合硅胶和Sigmacote处理后，即可固定玻璃板。该方法是用02mm或04mm厚的边条置于玻璃板左右两侧，将另一块玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘，用夹子固定住。

（2）根据所需要的凝胶浓度，按下表制备测序凝胶，一般6%-8%的胶浓度可获得较好的结果。配制过程中，先用适量双蒸水溶解尿素，再加入 Acr&Bis和10×TBE缓冲液，再用双蒸水调终体积至992ml，并用045mm的滤膜过滤，然后加过硫酸铵和TEMED。溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后，方可加入TEMED和过硫酸铵。一般在胶灌制后4-6分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的 TEMED和过硫酸铵。

凝胶终浓度

3 4 5 6 8 12 16 18

尿素(g) 420 420 420 420 420 420 420 420

Acr&Bis(ml) 75 100 120 145 200 300 400 500

10×TBE缓冲液(ml) 100 100 100 100 100 100 100 100

双蒸水(ml) 475 450 430 405 350 250 150 50

10%过硫酸铵(ml) 08 08 08 08 08 08 07 07

TEMED(ml) 87 80 80 80 80 70 47 40

(3)胶配制好后，即可灌制胶板。一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。

[注意] 1、使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。

2、灌制凝胶的过程中要严防产生气泡，否则影响测序的结果。

（三）电泳：

1、预电泳

（1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。

（2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE缓冲液。

（3）稀释10×TBE缓冲液至1×TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳槽中，去除产生的气泡，接上电源准备预电泳。

（4）有些电泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加热的，则应先将水浴加热至55℃后进行预电泳。有的不使用水浴加热，依靠电泳过程中自身产生的热进行保温，如上海求精有机玻璃仪器生产的测序电泳槽，这种槽需夹上二块散热铝板，使整个凝胶板的温度一致。

（5）按30V/cm的电压预电泳20-30分钟。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC丰富区形成的发夹状结构，影响测序的结果。

[注意]

（1） 用鲨鱼齿梳制作加样孔时，应注意将齿尖插入胶中05mm左右，千万注意不能使加样孔渗漏，否则得不到正确的结果。

（2） 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏，否则极易造成短路而损坏电泳仪。

2、样品的制备：

当在预电泳时，即可进行样品的制备，将反应完毕的样品在沸水浴中加热1-3分钟，立即置于冰上即可。如果样品长时间不用，则应重新处理。可使用4- 6%聚丙烯酰胺凝胶，胶厚04mm。厚度小于04mm的胶可能导致信号太弱。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油，但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。

3、上样及电泳

关闭电泳仪，用移液q吸缓冲液清洗样品孔，去除在预电泳时扩散出来的尿素，然后立即用毛细管进样器吸取样品，加入样品孔中。上样顺序一般为G、A、 T、C。加样完毕后，立即电泳。开始可用30V/cm进行电泳，5分钟后可提高至40-60V/cm，并保持恒压状态。一般来说，一个55cm长， 02mm厚的凝胶板，在2500V恒压状态下电泳2小时即可走到底部，同时在电泳过程中，电流可稳定地从28mA降至25mA。为了能读到更长的序列，可采用两轮或多轮上样。

[注意]

1、上样电泳时，一定要注意凝胶板的温度是否达到55℃左右，如果还没有达到，则应等温度达到后才能上样电泳。

2、一般来说电泳时，不宜使用太高的电压，因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低，并且使带扩散。电泳中可进行恒功率电泳。

（四）、 测序凝胶的银染

染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。

1 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。

2 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。

3 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。

4 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。

5 凝胶显影：

(1) 在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制。

(2) 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10秒。注意，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5-10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。

(3) 立刻将凝胶转移至1升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2--3分钟,或直至所有条带出现。

6 固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应,固定凝胶。

7 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注意在本 *** 作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。

8 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，**背景(如纸)上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。

[注意] 测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法，本系统的成败受几个因素的影响。

1 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或双蒸水可获得较好的效果, 如果水中有杂质, 则低分子量条带可能无法出现。

2 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的，美国化学学会级碳酸钠较好，如Fisher和Kodak ACS试剂级碳酸钠(Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990)，一般可获得较好的结果。

3 染色后的洗涤步骤是非常关键的。如果凝胶洗涤时间太长，银颗粒会脱离DNA, 产生很少或没有序列信号。如果洗涤时间过长，染色步骤可以重新进行。

4 如果凝胶厚度超过04mm或丙烯酰胺浓度高于4-6%，则有必要延长固定和染色的时间。如果凝胶比04mm薄，染色反应后的洗涤必须缩短至不超过5秒。

5 在室温下进行所有步骤，显影反应除外。显影溶液必须预冷至10-12℃以减小背景杂色。注意：临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠。用新配的染色及显影溶液。不要重复使用任何溶液。

成功地使用银染测序系统需要对提供的 *** 作方法进行仔细考虑。银染不如放射性检测法灵敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通过延长X-光胶片曝光时间的方法增加信号强度。因此，请使用推荐的DNA模板量, 每次均使用所提供的对照检查系统的可靠性，并且注意如下几点：

（1） DNA的浓度和纯度必须经过琼脂糖凝胶电泳或荧光法测定, 样品应与已知量DNA一起电泳。

（2） 分光光度法对于很多DNA提取物包括质粒小量制备来说，并不能给出一个可信的DNA浓度估计，混杂的染色体DNA、蛋白、RNA、有机物及无机化合物均可能有260 nm光吸收。因此，分光光度法常常错误地高估DNA浓度。

（3） DNA制备过程中用核糖核酸酶处理所产生核糖核苷酸，虽然它们在电泳后DNA样品的前面，并不能观察到，但它们仍会有260nm光吸收。

（一）测序反应：

1 对于每组测序反应，标记四个05ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20ml)矿物油，盖上盖子保存于冰上或4℃备用。

2 对于每组四个测序反应,在一个eppendorf管中混合以下试剂：

（1） 样品反应：

质粒模板DNA 21pmol

5×测序缓冲液 5ml

引物 45pmol

无菌ddH2O 至终体积16ml

（2）对照反应

pGEM-3Zf(+)对照DNA(4mg) 40ml

5×测序缓冲液 5ml

pUC/M13正向引物(45pmol) 36ml

无菌ddH2 O 至终体积 16 ml

3 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入10ml测序级Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸动几次混匀。

4 从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。

5 在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。

6 把反应管放入预热至95℃的热循环仪，以[注意]中循环模式为基准，开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350碱基的长度。

7 热循环程序完成后，在每个小管内加入3μl DNA测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。

[注意] 1、测序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：

模板种类/长度 模板量

200bp (PCR产物) 16ng(120fmol)

3000-5000bp（超螺旋质粒DNA) 4mg (2pmol)

48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol)

由于超螺旋质粒产生的信号比松弛的线性双链DNA弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。

2、计算与45pmol相当的引物纳克数可用以下一般公式：

45pmol=15ng×n,其中n为引物碱基数

计算与1pmol相当的引物微克数可用以下一般公式：

dsDNA:1pmol=(66×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基对数

ssDNA:1pmol=(33×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基数

3、为阻止Taq DNA聚合酶延伸非特异性退火引物， 热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式，建议从模式1开始。

模式1：适用于引物<24碱基或GC含量<50%

95℃ 2分钟。然后： 95℃ 30秒(变性), 42℃ 30秒(退火), 70℃ 1分钟(延伸)。

模式2:适用于≥24碱基或略短的GC含量≥50%的引物。

95℃ 2分钟, 然后: 95℃ 30秒(变性), 70℃ 30秒(退火/延伸)。 4 在加入终止溶液之后样品可在4℃保存过夜。

（二）、 测序凝胶板的制备

1、玻璃板的处理：

银染测序的玻璃板一定要非常清洁，一般先用温水和去污剂洗涤，再用去离子水冲洗玻璃板，除去残留的去污剂，最后用乙醇清洗玻璃板。玻璃板上遗留的去污剂微膜可能导致凝胶染色时背景偏高(棕色)。短玻璃板经粘合溶液处理可将凝胶化学交联于玻璃板上。这一步对于在银染 *** 作过程中防止凝胶撕裂至关重要。

（1）短玻璃板的处理

A 在1ml 95%乙醇, 05%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane), 配成新鲜的粘合溶液。

B 用经浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉纸擦拭仔细清洗过并已经自然干燥的玻璃板, 整个板面都必须擦拭。

C 4-5分钟后, 用95%乙醇单向擦玻璃板, 然后略用力沿垂直方向擦拭。重复三次这一清洗过程, 每次均须换用干净的纸, 除去多余的粘合溶液。

[注意] 1 在95%乙醇单向擦玻璃板时过度用力会带走过多的粘合硅烷, 使凝胶不能很好地粘附。

2 准备长玻璃板之前要更换手套，防止粘染粘合硅烷。

3、防止粘合溶液沾染在长玻璃板上是很重要的, 否则将导致凝胶撕裂。

(2)、长玻璃板的处理

A 用浸透Sigmacote溶液的棉纸擦拭清洗过的长玻璃板。

B 5-10分钟后用吸水棉纸擦拭玻璃板以除去多余的Sigmacote溶液。

[注意] 1 用过的凝胶可在水中浸泡后用剃须刀片或塑料刮刀刮去。玻璃板须用去污剂完全清洗。或者凝胶用10% NaOH浸泡后除去。为防止交叉污染, 用于清洗短玻璃板的工具必须与清洗长玻璃板的工具分开, 如果出现交叉污染, 以后制备的凝胶可能撕裂或变得松弛。

2、凝胶的制备：

（1）玻璃板经粘合硅胶和Sigmacote处理后，即可固定玻璃板。该方法是用02mm或04mm厚的边条置于玻璃板左右两侧，将另一块玻璃板压于其上。在长玻璃板的一侧插入鲨鱼齿梳平的一面边缘，用夹子固定住。

（2）根据所需要的凝胶浓度，按下表制备测序凝胶，一般6%-8%的胶浓度可获得较好的结果。配制过程中，先用适量双蒸水溶解尿素，再加入 Acr&Bis和10×TBE缓冲液，再用双蒸水调终体积至992ml，并用045mm的滤膜过滤，然后加过硫酸铵和TEMED。溶解尿素时不必加热。如果确需加热则应等溶液完全冷却后，方可加入TEMED和过硫酸铵。一般在胶灌制后4-6分钟，即开始聚合，如果聚合不好，则应使用高浓度的 TEMED和过硫酸铵。

凝胶终浓度

3 4 5 6 8 12 16 18

尿素(g) 420 420 420 420 420 420 420 420

Acr&Bis(ml) 75 100 120 145 200 300 400 500

10×TBE缓冲液(ml) 100 100 100 100 100 100 100 100

双蒸水(ml) 475 450 430 405 350 250 150 50

10%过硫酸铵(ml) 08 08 08 08 08 08 07 07

TEMED(ml) 87 80 80 80 80 70 47 40

(3)胶配制好后，即可灌制胶板。一般是将凝胶沿着压条边缘缓慢地倒入玻璃板的槽中，倒完后，静止放置使之聚合完全。

[注意] 1、使用夹子固定玻璃板时，最好夹子的力量稍大一些，防止因力量不足使灌胶的过程中出现漏胶液现象。

2、灌制凝胶的过程中要严防产生气泡，否则影响测序的结果。

（三）电泳：

1、预电泳

（1）当凝胶聚合完全后，拨出鲨鱼齿梳，将该梳子反过来，把有齿的一头插入凝胶中，形成加样孔。

（2）立即将胶板固定在测序凝胶槽中，一般测序凝胶槽的上下槽是分开的，因而只有在固定好凝胶板后，方能加入TBE缓冲液。

（3）稀释10×TBE缓冲液至1×TBE，将该缓冲液加入上下二个电泳槽中，去除产生的气泡，接上电源准备预电泳。

（4）有些电泳槽，如LKB的Macrophor等是使用水浴加热的，则应先将水浴加热至55℃后进行预电泳。有的不使用水浴加热，依靠电泳过程中自身产生的热进行保温，如上海求精有机玻璃仪器生产的测序电泳槽，这种槽需夹上二块散热铝板，使整个凝胶板的温度一致。

（5）按30V/cm的电压预电泳20-30分钟。预电泳的过程是去除凝胶的杂质离子，同时使凝胶板达到所需的温度。高温电泳可防止GC丰富区形成的发夹状结构，影响测序的结果。

[注意]

（1） 用鲨鱼齿梳制作加样孔时，应注意将齿尖插入胶中05mm左右，千万注意不能使加样孔渗漏，否则得不到正确的结果。

（2） 应时刻注意上面电泳槽中的缓冲液是否渗漏，否则极易造成短路而损坏电泳仪。

2、样品的制备：

当在预电泳时，即可进行样品的制备，将反应完毕的样品在沸水浴中加热1-3分钟，立即置于冰上即可。如果样品长时间不用，则应重新处理。可使用4- 6%聚丙烯酰胺凝胶，胶厚04mm。厚度小于04mm的胶可能导致信号太弱。加样时不必吸去上层覆盖的矿物油，但要小心地吸取矿物油下的蓝色样品。

3、上样及电泳

关闭电泳仪，用移液q吸缓冲液清洗样品孔，去除在预电泳时扩散出来的尿素，然后立即用毛细管进样器吸取样品，加入样品孔中。上样顺序一般为G、A、 T、C。加样完毕后，立即电泳。开始可用30V/cm进行电泳，5分钟后可提高至40-60V/cm，并保持恒压状态。一般来说，一个55cm长， 02mm厚的凝胶板，在2500V恒压状态下电泳2小时即可走到底部，同时在电泳过程中，电流可稳定地从28mA降至25mA。为了能读到更长的序列，可采用两轮或多轮上样。

[注意]

1、上样电泳时，一定要注意凝胶板的温度是否达到55℃左右，如果还没有达到，则应等温度达到后才能上样电泳。

2、一般来说电泳时，不宜使用太高的电压，因为太高的电压会使凝胶的分辨率降低，并且使带扩散。电泳中可进行恒功率电泳。

（四）、 测序凝胶的银染

染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。

1 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。

2 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。

3 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。

4 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。

5 凝胶显影：

(1) 在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制。

(2) 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10秒。注意，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5-10秒。浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。

(3) 立刻将凝胶转移至1升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2--3分钟,或直至所有条带出现。

6 固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。停止显影反应,固定凝胶。

7 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注意在本 *** 作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。

8 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。在可见光灯箱或亮白，**背景(如纸)上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。

[注意] 测序产物的银染是显现序列信息的一种新方法，本系统的成败受几个因素的影响。

1 水的质量对于染色的成功极其重要。超纯水(NANOpureR 或Milli-QR 的水)或双蒸水可获得较好的效果, 如果水中有杂质, 则低分子量条带可能无法出现。

2 碳酸钠也非常重要。使用新鲜的，美国化学学会级碳酸钠较好，如Fisher和Kodak ACS试剂级碳酸钠(Fisher Cat #S263-500或S262-3，或Kodak Cat #109-1990)，一般可获得较好的结果。

3 染色后的洗涤步骤是非常关键的。如果凝胶洗涤时间太长，银颗粒会脱离DNA, 产生很少或没有序列信号。如果洗涤时间过长，染色步骤可以重新进行。

4 如果凝胶厚度超过04mm或丙烯酰胺浓度高于4-6%，则有必要延长固定和染色的时间。如果凝胶比04mm薄，染色反应后的洗涤必须缩短至不超过5秒。

5 在室温下进行所有步骤，显影反应除外。显影溶液必须预冷至10-12℃以减小背景杂色。注意：临用前在显影溶液中加入甲醛和硫代硫酸钠。用新配的染色及显影溶液。不要重复使用任何溶液。

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