基因克隆的基本步骤有哪些

基因克隆的基本步骤流程如下：

一、目的DNA片段的获得：

DNA克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子，这些DNA分子或来自于目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链 cDNA分子。

由于基因组DNA较大，不利于克隆，因此有必要将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。若是基因序列已知而且比较小就可用人工化学直接合成。如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DNA 或cDNA中通过PCR技术可以获得目的基因。

二、载体的选择：

基因克隆常用的载体有：质粒载体、噬菌体载体、柯斯质粒载体、单链DNA噬菌体载体、噬粒载体及酵母人工染色体等。从总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为克隆载体、表达载体、测序载体、穿梭载体等。

三、体外重组：

体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。大多数核酸限制性内切酶能够切割DNA分子形成有黏性末端，用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克隆位点便可获得相同的黏性末端，黏性末端彼此退火，通过T4 DNA连接酶的作用便可形成重组体，此为黏末端连接。

当目的DNA片断为平端，可以直接与带有平端载体相连，此为平末端连接，但连接效率比黏端相连差些。有时为了不同的克隆目的，如将平端DNA分子插入到带有黏末端的表达载体实现表达时，则要将平端DNA分子通过一些修饰；

如同聚物加尾，加衔接物或人工接头，PCR法引入酶切位点等，可以获得相应的黏末端，然后进行连接，此为修饰黏末端连接。

四、导入受体细胞：

载体DNA分子上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点，因此可以在原核细胞如大肠杆菌中复制，重组载体中的目的基因随同载体一起被扩增，最终获得大量同一的重组DNA分子。

五、重组子的筛选：

从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。发展起来的成熟筛选方法如下：

（1）插入失活法：外源DNA片段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法（白色菌落是重组质粒）。

（2）PCR筛选和限制酶酶切法：提取转化子中的重组DNA分子作模板，根据目的基因已知的两端序列设计特异引物，通过PCR技术筛选阳性克隆。PCR法筛选出的阳性克隆，用限制性内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。

（3）核酸分子杂交法：制备目的基因特异的核酸探针，通过核酸分子杂交法从众多的转化子中筛选目的克隆。目的基因特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因片段,或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物种的同源基因。

（4）免疫学筛选法：获得目的基因表达的蛋白抗体，就可以采用免疫学筛选法获得目的基因克隆。这些抗体即可是从生物本身纯化出目的基因表达蛋白抗体，也可从目的基因部分ORF片段克隆在表达载体中获得表达蛋白的抗体。

扩展资料：

基因克隆的注意事项：

1、平端连接：DNA连接酶可催化相同和不同限制性核酸内切酶切割的平端之间的连接。原则上讲，限制酶切割DNA后产生的平端也属配伍末端，可彼此相互连接；若产生的粘性末端经特殊酶处理，使单链突出处被补齐或削平，变为平端，也可实行平端连接。

2、加尾连接：同聚物加尾连接是利用同聚物序列，如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。在末端转移酶作用下，在DNA片段端制造出粘性末端，而后进行粘性末端连接。这是一种人工提高连接效率的方法，也属于粘性末端连接的一种特殊形式。

3、人工接头连接：对平端DNA片段或载体DNA，可在连接前将磷酸化的接头(linker)或适当分子连到平端，使产生新的限制性内切酶位点。再用识别新位点的限制性内切酶切除接头的远端，产生粘性末端。

参考资料来源：百度百科-基因克隆

参考资料来源：百度百科-DNA克隆

基因扩增技术的具体方法和程序

试剂（1）引物：决定扩增的特异性。根据检测的DNA不同，选用不同引物，每种病原微生物都有自己特异的引物。（2）耐热的DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温90℃-100℃。（3）10×PCR缓冲液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH84,20℃)150mmol/L MgCl2,1mg/ml明胶。10×PCR缓冲液随酶一起购买。（4）5mmol/L dNTP贮备液：将dATP、dCTP、dGTP和dTTP钠盐各100mg合并，加入灭菌去离子水溶解，用NaOH调pH至中性，分装每份300μl，-20℃保存。dNTP浓度最好用UV吸收法精确测定。现用dNTP溶液均有商品化产品。（5）DNA模板：用处理液将待测标本处理，不同处理方法、 *** 作各异，但目的是暴露标本中被检测的DNA。 *** 作程序过去标准的PCR *** 作程序是将PCR必需反应成份分别加入一微量离心管中，然后置于一定的循环参数条件下进阅读全文

基因扩增技术的具体方法和程序

试剂（1）引物：决定扩增的特异性。根据检测的DNA不同，选用不同引物，每种病原微生物都有自己特异的引物。（2）耐热的DNA聚合酶：此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温90℃-100℃。（3）10×PCR缓冲液：500mmol/l KCl;100mmol/L Tris-HCl(pH84,20℃)

2022-09-06 17:05News WIKI 相关搜索

PCR基因扩增仪的原理和程序

  PCR技术即基因扩增技术。     PCR基因扩增仪扩增DNA的原理是：先将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链经热变性处理解开为两个寡聚核苷酸单链，然后加入一对根据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为引物，即左右引物。此引物范围就在包括所欲扩增的DNA片

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100%有奖调查：聚合物的表征分析技术

什么是基因扩增？基因扩增的应用和技术优势

又称无细胞分子克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法,是基因扩增技术的一次重大革新。可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍,

您好：基因的选择性表达是指在细胞分化中,基因在特定的时间和空间条件下有选择表达的现象,其结果是形成了形态结构和生理功能不同的细胞细胞的全能性是指细胞经分裂和分化后仍具有形成完整有机体的潜能或特性

在多细胞生物中每个个体细胞的细胞核具有个体发育的全部基因,只要条件许可,都可发育成完整的个体

①高度分化的植物体细胞具有全能性,植物细胞在离体的情况下,在一定营养的物质,激素和其他适宜的外界条件下,才能表现其全能性②动物已分化的体细胞全能性受限制,但细胞核仍具有全能性

基因的选择性是指表达体内的一部分的基因,而程序性表达就是将要表达的基因按一定的顺序表达出来,简单的说,我有五种水果,橘子,香蕉,苹果,梨,葡萄,选择性就是我要吃哪三种,程序性就是我要先吃哪种、再吃哪种,最后吃哪种、

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