如何用primer5设计qpcr引物

引物长度，20bp；Tm值可以设置在55度（实验的时候可以用60度退火）；产物长度，100-150bp（如果没有合适的引物，产物长度可以设置在80-200）。

如需设计引物，可以微信搜索“为青生物”，由专业人员提供免费的荧光定量PCR引物设计服务。

生物学划分为两个时代：PCR前时代和PCR后时代，这是《纽约时报》对穆利斯先生发明PCR技术的评价。1983年，Kary B Mullis提出了PCR技术的构想， 1985年，他们在Science发表了相关的论文。论文由Mullis的同事Randall K Saiki领衔发表，1988年Saiki等分离纯化了Taq DNA聚合酶，并将其应用于PCR反应，使PCR变得更加简单、易行和稳定，随后PCR技术迎来了蓬勃发展的时期。PCR根据其分析精度，大致经历了以下三个阶段：（I）终点PCR：定性分析（II）定量PCR：相对定量（III）数字PCR：绝对定量

早期PCR主要用于定性分析，根据反应终点产物的有或无检测靶标序列存在与否，这种PCR可以称为终点PCR，在基因鉴定、病原核酸检测等领域具有广泛应用。

1990年，Simmonds等就通过对终点产物的梯度稀释对HCV、HIV等病原体进行了粗略的拷贝数鉴定，这可能是最早的定量PCR研究。不过需要澄清一下，这里所说的定量PCR还不是指荧光定量PCR，那时还没有将荧光物质用于PCR产物的监控。直到1992年，罗氏公司的R Higuchi等在Nature发表论文，介绍了将溴化乙锭（EB）用于PCR产物动态监控的方法，这可能是最早的荧光定量PCR技术了。1996年，ABi公司公布了基于Taqman探针的qPCR技术。1997年，Wittwer等比较了（i）基于双链特异性染料SYBR Green I（ii）基于5’-核酸酶和双标探针（iii）基于Cy5的分子信标的qPCR的特点。这些研究为后来qPCR的广泛应用奠定了基础。

一般，人们习惯把qPCR分为相对定量和绝对定量，不过本质上来说，qPCR只能用于相对定量，绝对定量的实现往往需要借助“外力”。 PCR扩增是一种指数扩增，理想状态下，产物浓度与起始浓度存在如下关系：N T = N 0 ×2 n （N 0 代表起始浓度，N T 代表终点浓度，n代表循环数），对公式两边取以对数可得：log N T = logN 0 + n×log2（log代表以自然常数e为底的对数），如果我们把PCR终点的判断信号固定成一个统一的值（即qPCR中的荧光阈值），那么循环数与起始浓度的对数就成了线性关系，这就是qPCR相对定量的基本原理。不过有两个因素：（1）人的肉眼无法准确的判断PCR终点信号，于是出现了特殊的设备—荧光PCR仪；（2）不同的靶标基因的扩增效率不同，因此无法直接比较，因此催生了 ∆∆ Ct法。

真正的绝对定量PCR称为数字PCR（dPCR，1999年Kinzler等首次提出数字PCR的概念），它是在终点PCR和极限稀释的基础上通过泊松分布计算得出拷贝数的绝对定量方法。在Simmonds等的研究中，他们通过将DNA分子稀释到单拷贝，然后根据PCR的终点信号和泊松分布规律，计算了靶标基因的分子数目，不过他们没有进一步发展该技术，很长一段时间内该技术都是以分子计数的特点应用的。dPCR一方面因受到qPCR的长期压制，另一方面受到检测仪器的限制，直到2006年以后才逐渐显示出技术复苏的景象。

1993年，Zachar等在《核酸研究》上介绍了利用PCR对靶标基因进行相对定量的数学原理；2001年，Livak KJ等介绍了2 - ∆∆ Ct 法的推导过程，局限性及应用。

当然这些原理很简单，即使不看论文也很容易理解。因为PCR的指数扩增，当我们把终点的判断标准固定时，起始模板量高的样本最先到达，起始模板量低的样本消耗更多的循环数，并且每相差一个循环，代表起始浓度相差2倍，即N1/N2 = 2 -(Ct1-Ct2) 。检测不同样本时， ∆ Ct可能受样本量差异的影响，因此引入了内参基因的校正。内参基因，也叫管家基因或者看家基因，一般认为他们在生物体不同时空组织中保持恒定表达，那么两个样本内参基因的 ∆ Ct就代表了样本量的差异，靶标基因的 ∆ Ct – 内参基因的 ∆ Ct即为靶标基因的真实表达量差异，这就是2 - ∆∆ Ct 法。

但是有几个问题需要注意：（1）PCR并非全程都是指数增长期，比较必须在对数扩增期进行（2）一般默认对数增长期扩增效率是100%，这并不严谨，尤其是一些扩增困难的模板，效率可能与100%差异很大，纵向分析某基因的表达量（如基因A在不同生产阶段/不同组织的表达量）时，仍使用2 - ∆∆ Ct 可能并不太准确（3）不同靶标基因的扩增效率是不同的，因此横向比较不同靶标基因时，可能造成较大的误差。

鉴于此，我们在设计引物时，应该尽可能使靶标的长度、GC%、Tm保持接近，从而保证相近的扩增效率。 PrimerBank 和 qPrimerDB 分别是国外和国内比较优秀的qPCR引物检索网站，收录了大量物种的qPCR引物数据，具有一定参考价值。此外，Pfaffl等(2001)，Rao(2013)等对2 - ∆∆ Ct 法进行了一些校正，采用的方法主要就是通过对同一模板梯度稀释进行扩增效率校正，具有一定参考意义。

qPCR绝对定量有两种方法：（1）先获得一个拷贝数已知的参照基因，再获得靶标基因与该参照的比值，然后根据已知值获得检测样本的确切数目，从这个角度看绝对定量就是借助了“拷贝数已知”这一外力的相对定量。1990年，Gilliland等就描述了这一原理。（2）Simmonds等报道的方法，将DNA模板做极限稀释，一直到PCR体系中仅含有一个模板分子，此时只需要乘以稀释倍数就可以得到样本中靶标基因的拷贝数。这一方法是dPCR的技术原型，在实际 *** 作中很有困难，首先需要很多稀释梯度，其次普通的10-20uL体系中仅含有一个模板分子经常很难扩增成功。

绝对定量最广泛的应用是分子计数，如RNA分子数的精确测定，DNA基因组上的基因拷贝数鉴定等。Southern杂交法是外源基因拷贝数鉴定使用最广泛的方法，但随着qPCR技术的不断发展，基于qPCR绝对定量的拷贝数鉴定的报道逐渐增多，并且大量研究表明qPCR方法与Southern杂交得到的结果基本一致甚至更加精确。Song等(2002)利用qRT-PCR估计了转基因玉米愈伤组织和植物中的转基因拷贝数，该研究还使用Southern杂交重新测量了玉米愈伤组织和植物中的“精确”转基因拷贝数，结果qRT-PCR的测量结果与“精确”结果有较高相关性，因此，他们认为 qRT-PCR可以作为一种评估转基因玉米拷贝数的有效手段。

拷贝数鉴定的关键是获得一个拷贝数已知的标准品，质粒容易提取和纯化，因此常用于构建绝对定量的标准品。把携带靶标基因的重组质粒提纯到极高的纯度，精确测定其核酸浓度，根据公式：N = 602 × 10 23 (copy/mol) × M DNA (g) / (DNA length(bp) × 650(g/mol/bp)) 即可计算出标准品拷贝数，式中N代表分子数目，M DNA 代表质粒重量。以此标准品绘制logN与Ct的标准曲线，然后根据靶标基因的Ct值即可反推出靶标基因的精确个数。同时我们要从基因组上选择一个基因拷贝时已知的参照基因，按同样方式绘制标准曲线、进行分子计数，然后测定统一样本中把靶标基因与参照基因的分子数，带入上述公式即可得到靶标基因的实际拷贝数。一般，应该选择基因组上拷贝数较低，物种内保守性极高的基因作为参照基因。

拷贝数鉴定具有多种形式，双标准曲线并不是必需的，如果能够确认靶标基因与参照基因的扩增效率都接近100%，也可使用2 - ∆∆ Ct 法测量靶标基因的拷贝数，林维石等(2013)就通过该方法得到了与Southern杂交一致的拷贝数鉴定结果。

基因分型的方法有很多，Landegren等(1998)在报道中综述了多种用于基因分型的技术方法，其中发展到现在应用最为广泛的就是qPCR法和测序法。测序法最为准确，并且能够发现新基因型，是基因分型或SNP检测的金标准，但它比较慢，且 *** 作比较繁琐。qPCR检测 *** 作简单且速度极快，目前有十分广泛的应用。

qPCR法基因分型的基本原理是：3’-末端不匹配的引物无法正常扩增靶标基因。1989年，Wu等和Newton等先后报道了ASPCR法和法用于检测等位基因，这种方法容易理解，假设已知SNP位点为A/T，如果3’-A引物PCR产物产生终点信号可判断为A基因型，3’-T引物产生终点信号为T基因型，两种引物均产生信号即为杂合型。1995年，Livak等报道了利用不同荧光标记的探针检测SNP的方法，这种方法中，分别针对两种基因型设计两条不同荧光标记的探针，并设置纯和基因型的对照，随着PCR扩增如果荧光信号靠近A参照代表A基因型，靠近B参照代表B基因型，如果位于A和B之间则为杂合型（如下图）。

2003年，Papp等报道了一种基于高分辨率溶解曲线的SNP分型方法，这种方法也是基于3’-末端不匹配的引物，A基因型设计正常长度的引物，B基因型则在引物5’端添加10-15bp的高GC序列，经过PCR扩增后，不同基因型产物的Tm就会发生变化，依赖于qPCR仪的高分辨率溶解曲线，可以快速区分基因型。

1995年以后，qPCR相关的研究论文数量呈指数式增长，成为分子生物学最热门的领域之一。近年来，随着分子诊断行业的崛起，qPCR在医疗领域发挥着越来越重要的作用。qPCR在快速发展的同时，也产生了一些问题，如判断标准不一致，检测精确度没有统一标准，RNA检测假阳性较严重等。2009年，多个科研院所及医疗单位合作发布了qPCR的 MIQE指南 ，该指南规范了qPCR的常用术语，如Ct应称为Cq，RT-PCR应写作RT-qPCR等，并对分析的敏感性、特异性、精度等进行了规范性要求，此外指南还对样本处理、核酸提取、逆转录、qPCR甚至数据分析都作了详尽的规范。该指南由9部分组成，共85个参数，以确保以qPCR实验的实用性、准确性、正确性和可重复性。虽然该指南已经有些年份，但遵守这些规范能够让你的研究更易重复，也有助于审稿人和编辑快速评估你的稿件。

注：指南的内容和附表可以在这里获取： >

理性阐述 qPCR 实验的 Ct 值的合理范围。（附 Ct 值过大或过小的解决方法）

Ct 值是什么？

Ct 值具有什么样的作用？

Ct 值的正常范围是多少？

Ct 值太大或者太小的原因？

Ct值是荧光定量PCR最重要的结果呈现形式。它被用于计算基因表达量差异或者基因拷贝数。那么荧光定量的Ct值多大可被认为是合理？如何保证Ct值的有效范围呢？今天就让我来为大家解答这个问题。

Ct 值是什么？

qPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数（Cycle Threshold）。C代表Cycle，T代表Threshold。简单讲，Ct值就是qPCR中起始模板扩增达到一定产物量时，所对应的循环数。所谓“一定产物量”后续作进一步解释。

Ct 值有什么作用？

1指数扩增、模板量与Ct值的关系

理想情况下，qPCR中的基因经过一定的循环数被指数扩增而积累，扩增循环数和产物量之间的关系是： 扩增产物量 = 起始模板量×（ 1+E n ）循环个数 。然而qPCR反应并不是一直处于理想情况下，当扩增产物量达到“一定产物量”时，此时循环个数为Ct值，处于指数扩增时期。 Ct 值与起始模板量的关系 ：模板的Ct值与该模板的 起始拷贝数的对数存在线性关系 。起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。

2扩增曲线、荧光阈值与一定产物量

qPCR扩增产物量是以荧光信号的形式直接呈现，也就是扩增曲线。在PCR早期，扩增处于理想情况下，循环数较少，产物积累少，产生荧光的水平不能与荧光本底背景明显地区别，之后荧光的产生增加进入指数期。可以在PCR反应刚处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，以此作为“一定产物量”，并且由此来推断模板最初的含量。因此，一定产物量对应的荧光信号强度，也就是荧光阈值。

在PCR的后期，扩增曲线不再呈现指数扩增，进入线性期和平台期。

3Ct值的重现性

PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期，此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

Ct 值的范围？

1扩增效率En

PCR扩增效率是指聚合酶把待扩增基因转变生成扩增子的效率。由1个DNA分子转变生成2个DNA分子时的扩增效率为100%。扩增效率常用En表示。为了方便后续文章的分析，简要介绍下影响扩增效率的因素。

影响因素 解释 如何判定？

APCR抑制剂1模板RNA中可能含有抑制PCR反应的物质，如蛋白质或去污剂等。

2反转录后的cDNA中含有高浓度的模板RNA和反转录试剂成分，也可能对后续PCR存在抑制。

1可通过测定A260/A280和A260/A230比值或RNA电泳，判断是否存在污染。

2反转录后cDNA是否按照一定比例进行稀释。

B引物设计不合理引物不能有效退火检查引物是否存在二聚体或发夹结构、存在错配；有时需注意跨内含子设计。

C反应程序不合适1引物不能有效退火。

2DNA聚合酶活性未充分释放，

3长期高温，DNA聚合酶活性下降。

1退火温度高于引物Tm值。

2预变性时间太短。

3反应程序各阶段时间过长。

D试剂未充分混匀或移液误差反应体系中，PCR反应成分的局部浓度过高或不均匀，导致PCR扩增不呈指数扩增。

E扩增子长度扩增子长度太长，超过300bp，扩增效率低。检查扩增子长度是否在80bp-300bp之间。

FqPCR试剂的影响试剂中DNA聚合酶浓度较低或Buffer中离子浓度非最优化，导致Taq酶活力未达最强。标准曲线测定引物扩增效率。

2Ct值的范围

Ct值的范围为15-35。Ct值小于15，认为扩增在基线期范围内，未达到荧光阈值。理想情况下，Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系，也就是标准曲线。通过标准曲线，扩增效率为100%时，计算出基因单个拷贝数定量的Ct值在35左右，若大于35，理论上模板起始拷贝数小于1，可认为无意义。

对于不同的基因Ct范围，因起始模板量中基因拷贝数和扩增效率不同，需做出该基因的标准曲线，计算出基因的线性检测范围。

3Ct值的影响因素

由扩增循环数和产物量之间的关系： 扩增产物量 = 起始模板量×（ 1+E n ）循环个数 ，可以看出，在理想条件下，起始模板量和En会对Ct值产生影响。模板质量或者扩增效率的差异会造成Ct值偏大或过小。

4Ct值过大或过小

小翊威逼利诱了我公司技术部的牛牛们，总结出Ct值常见的两类问题的原因和解决方法，以飨读者。

问题 可能的原因 解决方法

Ct值过大1模板浓度低或存在PCR抑制物

2扩增效率低

1提高模板浓度；或提高RNA或cDNA稀释比例；或重新制备模板。

2降低退火温度，或选用二步法扩增；组分和体系充分混匀；优化反应程序；或尝试更换试剂。

Ct值过小1模板浓度高

2NTC和NRC存在污染

3引物设计不合适

1减少模板RNA量；或更高比例稀释cDNA。

2重新更换所有试剂；或使用UDGase防污染试剂。

3优化程序，避免非特性扩增。

一个小时。

1、对于qPCR由于需要跑溶解曲线，qPCR溶解曲线程序运行，该程序大概需要一个小时，所以要加一小时时间。

2、具体时间多长还要看仪器温度的升降速度，进口仪器升降速度较快，所以时间也会短一些。

检测细胞中病毒载体拷贝数的引物和探针、试剂盒、方法与流程

文档序号：28429449发布日期：2022-01-12 00:54阅读：1207来源：国知局

导航： X技术> 最新专利>有机化合物处理,合成应用技术

1本发明涉及细胞产品质量检测技术领域，尤其是指检测细胞中病毒载体拷贝数的引物和探针、试剂盒、方法。

背景技术：

2细胞产品制备质量控制以及患者注射细胞产品后的随访，均要求检测外源病毒载体基因拷贝数，以监控细胞内外源病毒载体基因拷贝数的变化。出于安全性考虑，现行政策要求：细胞产品中的外源病毒载体基因拷贝数不高于5拷贝/细胞。对患者体内的外源car或tcr拷贝数进行间接追踪，有利于评估car-t或tcr-t细胞在体内的存活。

3现时，国内外相关研究中，普遍使用实时荧光定量聚合酶链式反应法(qpcr法)进行基因拷贝数的测定。qpcr法是一种灵敏度高、特异性强且可通过实时监控进行定量的核酸检测技术。qpcr法最常用的有两种技术：一种是荧光染料法，但其与dna亲和力强，通常对pcr反应有抑制作用；另一种是荧光探针法，为序列特异性的taqman探针，灵敏度高，特异性强，已经被应用于生物制药的一些领域。国外已有相关文献研究利用探针qpcr法，建立外源基因拷贝数的检测方法，但针对某一采用特定载体的细胞的检测方法并不适用于工作载体或类型不同的细胞的质量控制检测中，对应的引物选择也存在差异。使用qpcr法检测细胞拷贝数时，既要保证能检出目标载体拷贝数，又要屏除细胞本身的核酸序列干扰，所以，引物的选择影响检测结果的可靠性和准确性。

技术实现要素：

4本发明所要解决的技术问题是：设计用于检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的引物，保证检测结果的可靠性和准确性。

5为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

6检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的引物和探针，引物由primer-f和primer-r组成，所述primer-f的序列示于seq id no：1，所述primer-r的序列示于seq id no：2，探针(probe)的序列示于seq id no：3；所述引物用于扩增病毒载体的部分序列和/或相应的互补序列，所述病毒载体的部分序列示于seq id no：4。

7一种试剂盒，包含质粒标准品以及上述所述的检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的引物和探针。

8进一步地，所述的试剂盒还包含premix ex taq、rox reference dyeⅱ和健康人基因组dna。

9进一步地，所述的试剂盒还包含ultrapure water和孔板。

10进一步地，所述primer-f的浓度为1～100μmol/l，所述primer-f的浓度为1～100μmol/l，所述探针的浓度为1～100μmol/l，所述质粒标准品的浓度为1

×

106～9

×

109copies/μl。

11进一步地，所述primer-f的浓度为10μmol/l，所述primer-f的浓度为10μmol/l，所

述探针的浓度为10μmol/l，所述质粒标准品的浓度为9

×

107～2

×

108copies/μl的msgv1标准品。

12一种检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的方法，采用上述所述的试剂盒，以所述质粒标准品构建标准曲线，以所述引物和探针构建qpcr检测体系检测得到细胞基因组中病毒载体的拷贝数。

13进一步地，所述qpcr检测体系包括标准曲线qpcr反应体系和样品qpcr反应体系；所述标准曲线qpcr反应体系由premix ex taq、primer-f、primer-r、探针、rox reference dyeⅱ、健康人基因组dna、ultrapure water和质粒标准品组成，所述样品qpcr反应体系由premix ex taq、primer-f、primer-r、探针、rox reference dyeⅱ、ultrapure water和样品组成。

14进一步地，所述qpcr检测体系的反应程序为：在95

±

1℃的条件下预变性60

±

3s后，循环进行35-42个的pcr反应；所述pcr反应先在95

±

1℃的条件下反应4-7s，然后在在62

±

1℃的条件下反应30-38s。

15进一步地，所述健康人基因组dna和所述样品均经过相同的样品处理过程处理；所述样品包括待测样品、阴性对照样品和质控样品；所述样品处理过程为样品dna的提取；所述质粒标准品为msgv1标准品。

16本发明的有益效果在于：通过病毒载体将插入序列整合到细胞的基因组中，部分病毒载体元件序列(例如：示于seq id no：5的病毒载体元件)和/或相应的互补序列也会被整合到细胞的基因组中。通过所设计的引物和探针，扩增该部分病毒载体元件序列，能够特异性地检测出病毒载体拷贝数。引物和探针的特异性好，所作用的部分病毒载体元件序列与人基因组无相似性，投放引物和探针后，不会扩增任何除该部分病毒载体元件序列以外的序列，因而检测准确度高。此外，引物和探针在应用时，灵敏度高、精密度高。

附图说明

17下面结合附图详述本发明的具体结构

18图1为本发明的检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的引物和探针、试剂盒、方法的实施例标准曲线图；

19图2为本发明的检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的引物和探针、试剂盒、方法的实施例扩增曲线图。

具体实施方式

20下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

21实施例

221材料

2311样品

24待测样品：细胞样品(car-t细胞)(该细胞样品是基于msgv1-1d3-28z1-3mut载体

质粒，经过将插入基因1d3-28z1-3mut去除，并插入car基因后制备的质粒，利用pg13细胞包装成病毒载体，然后再侵染患者t淋巴细胞，制成的细胞制剂。)

25阴性对照细胞：活化未转导t细胞(nc-t细胞)

26msgv1标准品(stock):108copies/μl

27健康人基因组：100ng/μl

2812试剂

29(1)台盼蓝(trypan blue stain)(04％)，gibco；

30(2)血液/组织/细胞基因组提取试剂盒，天根生物；

31(3)rnasea，天根生物，100mg/ml；

32(4)quant-ittm picogreentm dsdnaassay kit，invitrogen；

33(5)ultrapure dnase/rnase-free distilledwater(以下简称ultrapure water)，invitrogen；

34(6)premix ex taq(probe qpcr)(taqman探针法预混型试剂)，takara；

35(7)primer-f、primer-r、probe，生工生物。

363检验过程

3731细胞样品处理

38将car-t细胞和nc-t细胞轻轻吹打混匀后，进行细胞计数，测定细胞密度，取出所需要的细胞(≤5

×

106/管)，1500rpm离心3min，去上清，加入1ml1

×

pbs溶液，重悬细胞。

3932细胞基因组dna(gdna)的提取

40按照天根生物的《血液/组织/细胞基因组提取试剂盒》 *** 作说明书提取car-t细胞基因组dna、nc-t细胞基因组dna。

4133picogreen法精确测定细胞基因组dna的浓度

42按照《quant-it

tm picogreen

tm dsdnaassay kit》试剂盒说明书精确测定car-t细胞基因组dna、nc-t细胞基因组dna的浓度。

4334qpcr检测

44341qpcr反应体系的配制

45(1)将premix ex taq(probe qpcr)(2

×

conc)、rox reference dye ii(50

×

conc)、正反引物及探针(均为10μm)、健康人基因组dna放4℃冰箱避光解冻。

46(2)标准品的反应体系按照表1配制：

47表1标准曲线qpcr反应体系配制

48[0049][0050]

注：#实际添加的是采用msgv1标准品稀释后的各个梯度浓度的稀释液，详见表3。

[0051]

(3)样品的反应体系按照表2配制：

[0052]

表2样品的qpcr反应体系配制

[0053][0054]

注：同一反应孔中，样品包括待测样品、阴性对照样品和质控样品，待测样品为car-t细胞基因组dna、阴性对照样品为nc-t细胞基因组dna、质控样品为加标nc-t细胞基因组dna。nc-t细胞为患者t细胞，nc-t细胞对应的dna称为nc-t细胞基因组dna。

[0055]

342样品的稀释

[0056]

使用ultrapure water将car-t细胞基因组dna和nc-t细胞基因组dna稀释为10ng/μl，稀释液体积不少于20μl。侧壁轻d3次后放至微型离心机离心3秒，放常温待用。

[0057]

343标准曲线用msgv1标准品的各个梯度浓度按照表3配制：

[0058]

表3msgv1标准品梯度稀释表

[0059][0060]

344质控样品用标准品溶液的配制：

[0061]

质控样品：样品采用加标nc-t细胞基因组dna时，该孔的反应体系为质控样品。加标nc-t细胞基因组dna的配制方法为：在nc-t细胞基因组样品中加入已知浓度的msgv1标准品——本实施例中，反应孔中存在50ng的nc-t细胞基因组dna和2500拷贝的msgv1标准品。

[0062]

345上机检测

[0063]

(1)设置靶点：靶点名称为“msgv”，报告荧光基团为“fam”，猝灭荧光基团为“nfq-mgb”，检测参比荧光为“rox”。

[0064]

(2)设置样品：根据实际设置样品名称。

[0065]

(3)输入板布局：根据实际点板情况填入板布局，系列标准品的孔设置为“s”孔，填入系列标准品的上样拷贝数。无模板阴性对照孔(ntc)设置为“n”，检测样品孔设置为“u”。

[0066]

(4)按照表4设置反应程序：

[0067]

表4qpcr反应程序

[0068][0069]

346结果分析

[0070]

打开保存的文件，点击分析按钮(analyze)，数据分析后导出excel表。具体结果详见表5、图1以及图2。

[0071]

表5待测样品msgv1载体拷贝数检测结果

[0072][0073]

347待测样品外源msgv1病毒载体拷贝数的计算

[0074]

(1)上样car-t细胞数计算：

[0075]

每个细胞所含健康人基因组质量为66pg，待测样品的实际上样基因组质量为m，因此上样细胞数为：

[0076]

由于待测样品为10ng/μl的car-t基因组，共5μl，因此上样细胞数为：

[0077][0078]

(2)单个细胞的外源病毒载体基因平均拷贝数计算：

[0079][0080]

其中，c为待测样品的外源病毒载体基因拷贝数。

[0081]

348结果判定

[0082]

3481该实验结果同时满足以下条件，则实验结果方有效：

[0083]

(1)标准曲线相关系数r2应≥099，扩增效率应介于90％～110％之间；

[0084]

(2)无模板阴性对照(ntc)的ct值应为undetermined；

[0085]

(3)阴性对照(ncs)的ct值应为undetermined；

[0086]

(4)同一浓度标准曲线点、质控样品和同一待测样品的复孔ct值之间的标准偏差应≤05；

[0087]

(5)质控样品的回收率应介于70％～130％之间；

[0088]

3482待测样品的外源病毒载体基因平均拷贝数≤5copies/cell，则判定该批次细胞注射液外源病毒载体基因拷贝数检测合格。否则，判定不合格。

[0089]

上述实施例方法的可行性验证：

[0090]

将所设计的primer-f、primer-r、probe送上海生工生物有限公司合成，具体情况详见表6。获得引物或探针后，使用ultrapure water溶解引物或探针为10μmol/l溶液，分装至pcr管，-20℃冻存。

[0091]

表6探针和引物特征表

[0092][0093][0094]

注：产物的序列示于seq id no：4。

[0095]

(1)引物特异性验证：

[0096]

因car-t细胞本身和msgv1病毒载体中含有pg13细胞残留dna可能与msgv1病毒载体引物同源，因此设置检测样本为：水(ntc)、健康人pbmc基因组dna、nc-t细胞基因组dna、pg13细胞基因组dna。同时设置阳性对照样本：pmsgv质粒(基于msgv1-1d3-28z1-3mut载体质粒，经过将插入基因1d3-28z1-3mut去除，并插入tcr基因后制备的质粒)。

[0097]

将上述样本按实施例所示方法进行荧光定量pcr检测。结果如表7所示。

[0098]

表7特异性验证试验检测结果

[0099][0100]

根据表7结果可知，除了阳性对照样本，其余样本均未检出，说明本发明提供的引物和探针不会在这些样本中发生非特异性反应。因此，本发明检测细胞基因组中病毒载体

拷贝数检测试剂盒中的引物具有良好的特异性。

[0101]

(2)灵敏度试验：

[0102]

根据表3，将msgv1标准品(stock)用ultrapure water稀释成一系列浓度梯度样品：500000拷贝/反应、50000拷贝/反应、5000拷贝/反应、500拷贝/反应、50拷贝/反应，5拷贝/反应，分别标记为：st1、st2、st3、st4、st5、st6，所得的实施例标准曲线图详见图1，所得的实施例扩增曲线图详见图2。从图2的扩增曲线图中可知：扩增曲线有明显的指数增长期；从图1的标准曲线图中可知：线性方程为y＝-3214lgx+35915，即加入msgv1标准品的每个反应孔中，在5拷贝至500000拷贝之间呈良好的线性关系，ct值与dna模板量的lg值呈良好的线性关系，r2为1000，扩增效率介于90％～110％之间，检测灵敏度可达5拷贝/反应。

[0103]

重复三次试验，结果详见表8。从表8中可看出，额外三次实验结果的标准曲线，在dna模板量5拷贝/反应至500000拷贝/反应之间的线性很好，r2均在099以上，扩增效率介于90％～110％之间，所以，本技术的方法对tcr-t细胞dna的定量限loq可达5拷贝/反应，即1copies/μl。

[0104]

表8灵敏度试验标准曲线重复实验结果

[0105]

实验线性方程线性判定系数r2扩增效率％重复1y＝-3292lgx+363640999101264重复2y＝-3327lgx+36171099999801重复3y＝-3358lgx+36867099898496

[0106]

(3)准确度验证：

[0107]

在实施例的方法基础上，准确度分析采用加标回收的方法进行：往三批次nc-t细胞基因组dna中加入的msgv1标准品配制为：nc-t细胞基因组dna50ng/反应和对应高中低浓度(375000拷贝/反应，50000拷贝/反应和300拷贝/反应)的标准品，每个浓度3个复孔，由三名不同实验人员(chy、wjt、lqq)进行相同检验 *** 作，准确度(回收率)结果见表9。

[0108]

表9准确度试验回收率计算结果

[0109][0110][0111]

根据表9结果可知，在三次实验中，三批次nc-t细胞样品的高中低浓度加标回收率

均介于80％～120％之间，本发明的试剂盒及检测方法的准确度验证符合标准要求。

[0112]

(4)精密度验证：

[0113]

由三个不同实验人员对三个批次的car-t细胞样品进行检测。

[0114]

表10批内和批间精密度计算结果

[0115][0116]

根据表10结果可知，在三次实验中，三批次nc-t细胞样品的检测值的批内变异系数不超过20％、批间变异系数不超过25％。因此，本发明提供的试剂盒和检测方法的精密度验证符合标准要求。

[0117]

综上所述，本发明提供的检测细胞基因组中病毒载体拷贝数的引物和探针、试剂盒和方法中，引物和探针在应用时，检测的特异性好、准确度高、灵敏度高、精密度高，且定量限loq可达1copies/μl。故，本发明提供的试剂盒和检测方法的符合检测标准要求。

[0118]

msgv1标准品制备

[0119]

上述实施例和实验时所用的msgv1标准品(stock)由以下方法制备得到：

[0120]

1试剂

[0121]

(1)msgv1-1d3-28z1-3mut载体质粒(以下简称msgv1质粒)，addgene，#107227；

[0122]

(2)sali-hf，neb，

[0123]

(3)rsap(重组虾碱性磷酸酶)，neb；

[0124]

(4)ezna gel extractionkit，omega；

[0125]

(5)ultrapure dnase/rnase-free distilledwater(以下简称ultrapure water)，invitrogen；

[0126]

(6)quant-it

tm

dsdnaassay kit，invitrogen；

[0127]

(7)其它试剂：

[0128]

琼脂糖，50

×

tae dnaelectrophoresis buffer，核酸染料，6

×

loading buffer，dl5000 marker。

[0129]

2标准品的制备过程

[0130]

标准曲线的标准品为msgv1质粒的线性化产物，制备流程为：(1)酶切；(2)去磷酸化；(3)去磷酸化后产物的纯化；(4)picogreen法精确测定胶回收产物的浓度；(5)msgv1标准品拷贝数浓度的计算；(6)msgv1标准品的储存。

[0131]

各步骤详细流程为：

[0132]

21酶切

[0133]

使用sali-hf对msgv1质粒进行单酶切。具体酶切反应体系详见表11，具体反应程

序为：37℃，60min。

[0134]

表11 msgv1质粒单酶切反应体系

[0135][0136]

22去磷酸化

[0137]

使用重组虾碱性磷酸酶(rsap)对msgv1质粒的线性化产物进行去磷酸化，降低产物自连。

[0138]

(1) *** 作：往第21步反应完毕的酶切体系内直接加入2μl rsap，短暂离心混匀，然后按照以下反应程序进行反应：

[0139]

(2)反应程序：37℃，60min；65℃，5min。反应结束后，将反应产物放4℃保存。

[0140]

23去磷酸化后产物的纯化

[0141]

231琼脂糖凝胶电泳：

[0142]

(1)1％浓度的琼脂糖凝胶的配制：用量筒取100ml 1

×

tae缓冲液至三角瓶中，称取1g琼脂糖，加入至盛有1

×

tae缓冲液的三角瓶中，混匀，将溶液放置于微波炉中加热2～3min直至琼脂糖完全溶解后，在溶液中加入15μl gelred核酸染料，轻轻摇晃瓶子至染料充分混匀后，将梳子插入到凝胶槽中，将溶液倒至凝胶槽中，静置40min以上，直到凝胶充分凝固，凝胶凝固后拔出梳子。

[0143]

(2)电泳：向电泳槽中倒入1

×

tae缓冲液，缓冲液的量以没过凝胶为宜，然后将凝胶放入电泳槽中，取50μl产物加入10μl 6

×

loading buffer，将其充分混匀后点入凝胶孔中，取5μl dl5000 marker点入凝胶孔中，进行电泳，电泳条件：100v，35min。

[0144]

232凝胶回收目的基因：

[0145]

使用按照omega的gel extraction kit说明进行凝胶回收，提取目标条带。

[0146]

24 picogreen法精确测定胶回收产物的浓度：

[0147]

按照《quant-it

tm picogreen

tm dsdnaassay kit》(invitrogen，p11496)试剂盒说明书，精确测定胶回收产物的浓度。

[0148]

25 msgv1标准品拷贝数浓度的计算

[0149]

将精确定量后的msgv1胶回收产物定义为msgv1标准品，已知msgv1全长6941bp，按照下式计算msgv1标准品的拷贝数浓度：

[0150][0151]

其中：

[0152]

·

c为msgv1标准品通过picogreen精确定量的msgv1胶回收产物的浓度；

[0153]

·

602

×

10

23

为阿伏伽德罗常数；

[0154]

·

660g/(mol

·

bp)为双链dna每碱基对的平均分子质量；

[0155]

26 msgv1标准品的储存

[0156]

采用picogreen法精确定量地将msgv1标准品(stock)的拷贝数浓度稀释为108copies/μl，充分吹打混匀后，分装到02ml pcr管中，10μl/管，于-80℃冰箱保存。

[0157]

本发明实施例所用健康人基因组dna制备方法与待测样品基因组dna的制备相同，制备浓度为100ng/μl，-80℃冰箱保存。

[0158]

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

完整全部详细技术资料下载

当前第1页1 2 

该技术已申请专利。仅供学习研究，如用于商业用途，请联系技术所有人

实时荧光定量PCR

1996年，实时荧光定量PCR (real-time quantitative polymerase chain reaction，Real-time qPCR) 由美国Applied Biosystems公司首先推出，所谓Real-time qPCR是指在PCR反应中加入荧光基团，通过连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化，即时分析目的基因的初始量，该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。

荧光化学物质

目前根据Real-time qPCR所使用荧光化学物质不同，将其分为荧光染料和荧光探针两类。

荧光染料

荧光染料也称DNA结合染料，目前主要使用的染料分子是SYBR Green I，SYBR Green I能与DNA双链的小沟特异性的结合，游离的SYBR Green I几乎没有荧光信号，但结合双链DNA后，其荧光信号可呈数百倍的增加。随PCR产物的增加，PCR产物与染料的结合量也增大，其荧光信号强度代表双链DNA分子的数量。

荧光染料的优点：

使用简便；

可以与任何PCR产物结合；

价格便宜；

荧光染料的缺点：

不能区分不同的双链DNA

引物二聚体会影响检测的敏感性

非特异性产物会影响结果的敏感性

引物二聚体和非特异性扩增问题可以通过熔解曲线 (Melting curve) 进行识别，进而通过PCR引物的设计和反应条件的优化得以解决。

总的来说，SYBR Green I方法是一种最基础也最常用的Real-time qPCR实验手段。

荧光探针

Real-time qPCR中最常用的荧光探针为TaqMan探针，其基本原理是依据目的基因设计合成一个能够与之特异性杂交的探针，该探针的5'端标记荧光基团，3'端标记淬灭基团。

正常情况下两个基团的空间距离很近，荧光基因因淬灭而不能发出荧光。PCR扩增时，引物与该探针同时结合到模板上，探针的结合位置位于上下游引物之间。

当扩增延伸到探针结合的位置时，Taq酶利用5'外切酶活性，将探针5'端连接的荧光分子从探针上切割下来，从而使其发出荧光。检测到的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，因此，根据PCR反应体系中的荧光强度即可计算出初始DNA模板的数量。

TaqMan探针技术解决了荧光染料与非特异性扩增结合的问题，反应结束后无需通过熔解曲线检测，缩短了实验时间。

TaqMan探针技术的优点：

荧光背景低；

敏感性高；

杂交稳定性高；

荧光光谱分辨率好；

特异性高。

TaqMan探针技术的缺点：

成本高；

设计难度大；

只能用于检测产物长度低于150bp的反应。

由于TaqMan探针的高特异性，可用于等位基因的辨别，特别适用于人类基因多态性以及根据SNP区别和定量菌株。

Real-time qPCR技术的定量原理

扩增曲线

在Real-time qPCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的检测并记录其荧光信号，随着反应的进行，监测到的荧光信号可以绘制成一条曲线，即为扩增曲线。

荧光扩增曲线一般分为基线期、指数增长期和平台期。

在Real-time qPCR扩增早期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化，此时即为基线期。

PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数形式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数形式生成模板，从而进入“平台期”。在该时期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的终产物量与起始模板量之间无线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出初始模板量。

只有在荧光信号的指数增长期，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。

荧光阈值

为了便于对所检测样本进行比较，首先需设定一个荧光信号的阈值，荧光阈值是在扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上，一般荧光阈值设置为3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，但实际应用时要结合扩增效率、线性回归系数等参数来综合考虑。

通常荧光阈值都是Real-time qPCR仪器自动设置，如无特殊情况，无需更改。

循环阈值

循环阈值 (Cycle threshold valve, Ct) 即Real-time qPCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经过的扩增循环次数，Ct值与荧光阈值有关。

一般Ct值位于指数增长期的开始阶段，此时样品间细小物差尚未放大且扩增效率也相对恒定，因此该Ct值具有极好的重复性，尽管平台期的DNA拷贝数波动很大，Ct值却是相对固定的。

以上就是关于如何用primer5设计qpcr引物全部的内容，包括:如何用primer5设计qpcr引物、qPCR检测，你需要知道这些、理性阐述qPCR实验的Ct值的合理范围。等相关内容解答，如果想了解更多相关内容，可以关注我们，你们的支持是我们更新的动力！