PCR的反应包括三个主要步骤

PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：

1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

2、模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

3、延伸：DNA聚合酶由降温时结合上的引物开始沿着DNA链合成互补链。此阶段的温度依赖于DNA聚合酶。该步骤时间依赖于聚合酶以及需要合成的DNA片段长度。

传统的Taq估计合成1000bp大概需要1分钟、较新的Tbr（来自于嗜热菌Thermus brockianus）约40秒、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约10-15秒。有修正功能的则会比较慢。

扩展资料：

实例

优化聚合酶链式反应:

在实践中，聚合酶链式反应可以因各种原因而失败，部分原因是由于其对于污染的敏感性，导致扩增错误的DNA产物。正因为如此，人们已经开发了一些技术和步骤来优化聚合酶链式反应条件。将聚合酶链式反应前的混合物与潜在DNA污染物分开的实验室方案和流程解决了外源DNA的污染问题。

这通常包括从用于分析的区域分理出聚合酶链式反应的设定区域或者说聚合酶链式反应产物的纯化，一次性塑料制品的使用，及对反应装置之间的工作台面彻底清洁。引物的设计技术在改善聚合酶链式反应产物产率和避免杂产物的形成是很重要的。

替代缓冲成分和聚合酶的使用有助于较长或存在其他问题的DNA区域的扩增。在缓冲体系中加入试剂，如甲酰胺，或会增加聚合酶链式反应的特异性和产量。可以利用计算机模拟理论聚合酶链式反应结果（电子聚合酶链式反应），以协助在引物设计。

参考资料：

作QPCR的标准曲线可以用PCR－ELISA法作。

具体如下：

PCR－ELISA法：

利用地高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合；

再加入抗地高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。

常规的PCR－ELISA法只是定性实验，加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。

通过测定一系列已知组分的标准物质的某理化性质，从而得到该性质的数值所组成的曲线。

扩展资料：

实时荧光定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

检测方法：

1、SYBRGreenⅠ法：

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号。

而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

SYBR定量PCR扩增荧光曲线图、PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性）。

2、TaqMan探针法：

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；

PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。

即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省（默认）设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即：threshold = 10SDcycle 3-15。

利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

参考资料：

百度百科-实时荧光定量

百度百科-标准曲线

大家好！首先跟大家做一个自我介绍：

我是扩增曲线，来自荧光定量PCR，是用于描述qPCR动态进程的曲线，我有两种形态，一种是线性图谱：横坐标是循环数，纵坐标是荧光强度值；另一种是对数图谱：横坐标是循环数，纵坐标是荧光强度值的对数。大家根据我来确定Cq值，最终确定初始模板的含量。新冠疫情以来，我可是发挥了重要的作用，诊断技术的金标准，骄傲的很呢。

在引物、模板、缓冲液、酶等都充足的理想状态下，PCR扩增产物理论上是呈2的倍数增长的，所以我应该是长这个样子的：

但是呢，理想很美好，现实却很骨感，随着PCR循环数的增加，DNA聚合酶的失活、dNTP和引物的枯竭等诸多因素影响了PCR扩增效率，实际的我是长这样的：

不过S型的曲线，曼妙的身材，我还是很满意的。

大家也根据我将PCR进程分为4个时期，分别为基线期，指数增长期，线性增长期和平台期。我的特征还是很明显的：基线期平整；指数期起峰，陡度较大；线性期慢慢趋于平整；平台期基本平整。

如果大家在每次实验中都能遇到如此美丽的我，那就是“你好我好大家好”的欢快场景了。但是在实验过程中，大家可能会看到各种奇形怪状的我，分析不出原因，导致实验止步不前，因此茶饭不思，郁郁寡欢。

其实主要还是大家对我不太了解。我，作为大家的科研小助手，单纯善良，心思简单，没有那么多套路的。之所以出现奇奇怪怪的我，都是有原因的。接下来可都是满满的干货吆！笔记要做起来了吆！

一． 没有Cq值出现

1 反应循环数不够：一般设定在35个循环以上，也可根据实验情况增加循环数。

2 引物/探针设计不当或发生降解：优化引物/探针的设计；或通过PAGE电泳检测其完整性。

3 模板浓度低或降解导致：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；同时样品制备时尽量避免引入杂质和反复冻融。

二．Cq值偏大

1 模板浓度低：建议提高样本的上样量。

2 扩增效率低：反应条件不适宜或引物探针设计不当，建议通过绘制标准曲线确认扩增效率，同时对反应条件和引物探针设计进行优化。

3 PCR产物太长：一般采用80-150bp的产物长度。如果扩增产物过长，建议用三步法程序扩增或优化引物。

4 反应体系中可能有PCR反应抑制物：建议将模板梯度稀释后加入反应体系，或者重新制备纯度更高的模板。

三．扩增曲线末尾起跳，但没有完整扩增

1 可能存在污染：建议对样本进行复检。

2 如果是阴性对照，可能是引物二聚体或污染导致；如果是正常样本，说明浓度过低或者加样量不足。

四．复孔重复性差

1 加样误差导致：定期校准移液器；同时可先配制除模板以外的其他试剂的预混液，然后进行分装再加入模板，其次加大模板上样体积，以上均可降低移液误差的影响。

2 模板浓度越低，重复性越差。建议提高模板量，使Ct值在15-30之间。

现在大家对我的了解是不是又多了一些呢？是不是对qPCR实验又充满了信心呢？Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统，没有他就没有我那么多标致的，感受它的魅力呀！

在决定实时荧光定量PCR检测灵敏度、准确性和可靠性的众多因素中，模板质量是决定重复性和生物学相关性的重要因素之一。诸多报告中也描述了生物样品中常见的抑制成分会导致qPCR分析灵敏度和动力学的显著降低。

如何检测抑制剂：

多种方法可用于评估生物样品中是否存在抑制剂。常用方法是通过连续稀释样品来评估样品的PCR效率，PCR效率的高低一定程度上反映出样品质量的好坏。一个高效的PCR反应要求扩增效率在90%-110%之间，当扩增效率＞110%或＜90%，无论是相对定量还是绝对定量其最终结果都会不准确。那么怎么来判断是由于抑制剂引起的扩增效率异常呢？如图1所示，通过标准曲线的状态判断，当原液的数据点位于标曲上方（红色箭头），则极有可能是样本抑制剂抑制PCR反应导致Cq值偏大。

内部扩增控制（IACs）是一种与目标核酸共纯化和共扩增的方法，可用来检测抑制剂和指示加工过程中的模板丢失。IACs可包装在噬菌体外壳中，也可以是包含引物结合序列和探针检测序列的单链寡核苷酸。在荧光信号采集过程中，探针结合位点的部分不匹配阻止了与IACs杂交，随后可对熔解曲线进行分析，用以区分IACs和目标扩增子。IACs将是检测病原体的优质方案，但这种方法不适用于细胞mRNA定量，因为考虑为每个单一mRNA设计模拟物是不现实的。

另外，也可以通过使用外源性对照来测试抑制剂，也称为Spikes。该方法无论是在其构造技术的复杂性方面，还是在分析之后与它们的准确检测相关的额外工作方面，相对都是比较简单的。Spikes可以是RNA也可以是DNA分子，这取决于靶标类型。mRNA表达分析首选RNA Spikes，DNA靶标分析首选DNA Spikes。Spikes通常是几千个碱基/碱基对异型序列，所以不会与任何已知目标交叉反应。

抑制剂类型：

抑制剂可以是核酸提取过程中使用的试剂，也可以是从生物样品中提取的成分。抑制剂的影响，较好的情况是抑制剂会产生不准确的定量结果；最坏的情况是高度抑制会产生假阴性结果。常见的抑制剂类型如下：

1）样品本身的成分：许多生物样品本身就含有严重抑制逆转录和PCR反应的成分，如血液中的血红蛋白、免疫球蛋白G，肌肉中的肌红蛋白、胆盐、腐殖酸、尿素和胶原蛋白，植物中的多糖多酚等。

2）提取和纯化试剂的成分：许多用于纯化核酸的试剂，如苯酚、氯仿、硫氰酸胍、盐酸胍、乙二胺四乙酸、二甲基亚砜、十二烷基硫酸钠、噻唑、三唑和核糖核酸等。

如何降低抑制剂的影响：

当样本中存在抑制剂，高浓度模板中抑制剂浓度较高，对PCR反应的影响较大。低浓度模板由于稀释使得抑制剂浓度有所下降，抑制剂的抑制作用也相应降低。如果是样品本身的成分，可对模板进行稀释，或者进一步纯化，又或者改进提取方法来降低抑制剂的干扰。如果提取和纯化试剂的成分，其本身就是最有效的逆转录和聚合酶链反应的抑制剂，因此需要在提取和纯化过程中注意对试剂成分的去除，防治污染模板。

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