【现学现卖】实验-DNA测序（第一代至第三代）

测序，简单来说就是将DNA化学信号转变为计算机可处理的数字信号。

一代测序

首先讲一下测序的基础方法，Sanger测序 (Sanger et al.,1977)

1977年Frederick Sanger和同事发展出双脱氧测序法（dideoxy sequencing method）或称链终止法，并对噬菌体phiX-174测序以来，测序原理并未有太多变化。后来测序方法的改革也几乎都是在此基础上，缩短时间，降低人力，比如①在每一种ddNTP中掺入不同的荧光标记，使测序在单一反应中就能进行。②使用极薄极长的充胶玻璃毛细管代替大的聚丙烯酰胺凝胶块，新的介质散热更快，使电泳能在高压下进行，降低分离时间等诸如此类的减少分离时间的变革。③更换探查单一核苷酸的方法，用微转换器控制通过的电流检测核苷酸等等。

Sanger法测序需要引物，DNA聚合酶，脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs），有限量的双脱氧核苷三磷酸（ddNTPs）。按照碱基配对原则，dNTPs在引物之后按照模板延伸，ddNTPs的随机加入会由于它缺乏连接下一个的3’羟基而导致反应终止，由于ddNTPs的结合位置随机，我们会得到一系列大小不同的片段，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或同位素标记进行检测。也正是这个原理，所以测序得到较长的序列的概率低，长序列往往需要双向测序再进行拼接。

Maxam gilbert 化学法测序 (Maxam and Gilbert,1977)

几乎同时，Maxam和Gilbert发明了化学链降解法测序。

通过化学终止反应测序。首先双链变单链，准备工作完成。采用特定的化学试剂来从DNA链上断裂特定碱基，在5’端磷酸化（32P），四种化学反应：G反应，A+G反应，T+C反应，C反应，分别进行并产生一系列片段。然后进行电泳（electrophoresis），放射自显影（radioautography），最后可以整理得到序列。

二代测序（目前拥有这些测序仪的公司主要有Illumina，Thermo Fisher Scientific（已收购life，ABI， Ion torrent公司，所以在TFS官网可以找到这些测序仪），Roche）

一些和前后都没有紧密联系的概念

深度测序（deep sequencing）不是什么测序方法，而是根据对目的基因测序的depth和coverage（C）对测序方法的归类。如果这个片段被测序了大于7次（coverage>7），那么基本可以说是深度测序，大于100×称为ultra deep sequencing。还有一些概念比如length of genome（G）指全基因组长度，number of reads（N）片段数量，average read length（L）。

C=N×（L/G）

pyrosequencing 焦磷酸测序法 (Ronaghi, 2001) -454 二代测序 (Jarvie, 2005)

焦磷酸测序法

它后来发展称为Roche公司454技术所使用的测序方法。

是一种酶联级联测序技术，准确度可与Sanger媲美，且速度大大提高。具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量，低成本，快速地进行单核苷酸多态性（single nucle-otide potymorphisms, SNPs）研究提供了理想的技术支持。改进后的焦磷酸测序技术可以满足上百个核苷酸测序。但是测序长度一般在100bp左右，一直用于短序列分析。它的技术原理是4种酶在同一反应体系种级联化学发光反应，引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶（ATP sulfurytase），荧光素酶（luciferase）和磷酸酶（Apyrase）协同作用下，检测荧光，实时测定DNA序列。

454测序-固定的焦磷酸测序体系（2016年被Roche公司淘汰）

首先是序列处理：全基因组DNA处理为小的片段（鸟q法处理的），在一端连接两端分别连接A和B（可以在PCR中产生大量的目的序列），然后解链变成带有adaptors的单链DNA，这个adaptorA的序列可以与小珠子上面的短序列B匹配，这样我们要测序的片段就被固定了。小珠子是不可溶的且与酶不反应的分子，作为固定表面。然后进行乳化PCR，得到了满载分子的小珠子并将它们放入小孔。接下来是焦磷酸测序的原理，引物是adaptorA，每次反应加一种dNTP，如果可以碱基配对，会在DNA聚合酶下结合在引物末端，释放一个分子的焦磷酸（PPi）。在ATP硫酸化酶作用下，PPi与APS结合形成ATP，ATP与荧光素在荧光素酶作用下形成氧化荧光素，产生可见光。反应后冲洗掉剩余dNTP和少量ATP。

大多数现代测序方法都是分为这几步，主旨是实现高通量和自动化。①全基因组片段化。②adapter ligation末端连接短序列。③目标DNA与分子小珠子的结合。④将小珠子加载到孔板。⑤采用适合的方法测序。⑥数据处理。

连接酶法测序（Sequencing by ligation） (Albrecht et al.,2000) -ABI 公司SOLID测序  (Hedges et al.,2011)

连接酶测序法

利用的是DNA ligase的一个特性。连接酶是将DNA分子末端连接在一起的酶，它对DNA结构敏感，如果两条链的碱基不匹配，那么酶的效率很低。

具体如下图，模板链连接P1Adaptor，引入引物Pn与探针寡核苷酸混合物，一般8-9bp，前两个是与模板结合的碱基，中间三个为universal配对，后三个也是且5’连接荧光标记。在酶的作用下，正确配对的探针偏向与模板结合，然后荧光信号被检测并切除，露出5’端，继续反应。中间NNN的碱基部分可以通过加入引物Pn-1的方法，进行错位测序，之后整合数据。

ABI公司SOLID测序平台

在前期准备上与454测序相似，也会用到小分子的beads。但是测序方法为连接酶法，不是焦磷酸。

鸟q法（shotgun sequencing） (Sutton et al.,1995) 测序- Ion torrent 公司PGM测序 (Merriman et al.,2012)

鸟q法

传统的sanger法适合短一些的序列，当处理比如人类基因组的长序列时，需要鸟q法将长序列变成短序列。并不是一个独特的测序方法，应该算是前处理技术。这些通过鸟q法处理得到的短序列位点和长度随机，称为contigs（重叠群/连接片段）。然后用不同的测序方法测序，将结果输入电脑，它用算法（algorithm）将contigs的重叠部分进行拼接，得到完整序列。

Ion Torrent公司Proton测序仪

此方法比较快速。测序的原理与其他的不同，检测的不是荧光信号，而是核苷酸结合时释放的氢离子H+。同样全基因组→片段化，单链→连接adaptor→adaptors配对连接beads小分子→乳化PCR amplify。这些步骤与其他二代测序一样，不同的是Ion Torrent采用半导体芯片代替之前的孔板，加载携带序列的小分子在芯片上，芯片由可以承载小分子beads的孔和感受pH的传感器构成，这样前期准备就完成了。测序也是逐个加入四种核苷酸，检测产生的氢原子对溶液pH的影响，收集处理信号。

illumina 公司测序平台目前占据大部分市场，以HiSeq系列为主 (Quail et al., 2008)

特点是很便宜，速度也很快。①前期对基因组的片段化以及两端连接adaptorA,B与其他二代测序技术类似，②不同的是它没有用beads，核心反应容器是可以吸附流动DNA片段的测序流动槽（flowcell），每个flowcell上有8个道（lane），lane上面有与adaptorA,B相互配对的序列，所以可以固定DNA。③桥式PCR扩增与变性。先因为adaptorA,B序列而结合，形成拱桥性状，开始扩增，完成后双链和两端会再变性分开，新产生的单链作为模板再开始桥式反应。最后的结果是会产生一簇正反向的目的片段（详见下图）。④测序，检测荧光信号，整合结果。

第三代测序

PacBio公司的SMRT和OxfordNanopore Technologies纳米孔单分子测序技术被称为第三代测序技术。其特点是不需要进行扩增，就是说小分子beads/桥式PCR的步骤是不需要的，而且产生的reads（读长）较长（>20kb）。

PacBio 公司的SMRT (Rhoads and Au,2015)

这个方法有点在上面提了，且速度快，由于是实时检测，所以还可以检测碱基的表观修饰情况，如甲基化。但是缺点是错误率太高，以缺失序列和错位居多。SMRT芯片为测序载体（如同flowcell），不同碱基用不同荧光标记，在合成配对时检测荧光信号。

实现实时长序列测序的关键第一是采用的DNA聚合酶的活性保持，第二是区分配对的反应信号与周围游离碱基的强大背景荧光，采用零模波导孔原理，在反应管(SMRTCell:单分子实时反应孔)中有许多圆形纳米小孔达到降噪检测的目的。

Oxford Nanopore  的MinION (Mikheyev and Tin,2014)

是基于电信号的测序。它的特点是仪器真的非常小，reads更加长（几十甚至上百kb），而且DNA在测序中不被破坏，但是错误率同样很高。它能够直接读取出甲基化的胞嘧啶，而不必像二代测序方法那样需要事先对基因组进行bisulfite处理，这是因为存在表观修饰的碱基激发的电流强度是不同的。这对于在基因组水平直接研究表观遗传等相关现象有极大的帮助。

技术核心是特殊的纳米孔，孔内共价结合分子接头。当DNA分子通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），最后高灵敏度的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。

参考文献

Albrecht, G., Brenner, S., Dubridge, R.B., Lloyd, D.H., and Pallas, M.C. (2000) Massively parallel signature sequencing by ligation of encoded adaptors. In: Google Patents.

Hedges, D.J., Guettouche, T., Yang, S., Bademci, G., Diaz, A., Andersen, A. et al. (2011) Comparison of three targeted enrichment strategies on the SOLiD sequencing platform.  PloS one   6 .

Jarvie, T. (2005) Next generation sequencing technologies.  Drug Discovery Today: Technologies   2 : 255-260.

Maxam, A.M., and Gilbert, W. (1977) A new method for sequencing DNA.  Proceedings of the National Academy of Sciences   74 : 560-564.

Merriman, B., D Team, I.T., and Rothberg, J.M. (2012) Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing.  Electrophoresis   33 : 3397-3417.

Mikheyev, A.S., and Tin, M.M. (2014) A first look at the Oxford Nanopore MinION sequencer.  Molecular ecology resources   14 : 1097-1102.

Quail, M.A., Kozarewa, I., Smith, F., Scally, A., Stephens, P.J., Durbin, R. et al. (2008) A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.  Nature methods   5 : 1005.

Rhoads, A., and Au, K.F. (2015) PacBio sequencing and its applications.  Genomics, proteomics &bioinformatics   13 : 278-289.

Ronaghi, M. (2001) Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing.  Genome research   11 : 3-11.

Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A.R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.  Proceedings of the national academy of sciences   74 : 5463-5467.

Sutton, G.G., White, O., Adams, M.D., and Kerlavage, A.R. (1995) TIGR Assembler: A new tool for assembling large shotgun sequencing projects.  Genome Science and Technology   1 : 9-19.

IonTorrent基因分析仪组件：

IonTorrent与Illumina原理的主要区别：

Illumina：荧光信号

Ion Torrent：电信号

IonTorrent 核心理念：

核心理念：芯片就是测序仪

特点：扩展性、简捷、快速

半导体测序技术：

IonTorrent生物化学原理：

IonTorrent如何快速、直接检测：

Ion系列测序平台适用的chips及数据产出情况汇总：

PGM Chip：

314 Chip：1.2M Wells

316 Chip：6.1M Wells

318 Chip：11M Wells

Ion torrent测序过程：

Follow 和Cycle的含义：

一个“Follow”：将一个特定的dNTP(T, A, C, or G)打入芯片，随后进行洗脱；

一个“Cycle”：是由4个dNTP组成，例如：A-T-C-G= 1 Cycle。

测序时“Follow”的顺序是怎样的？

“Flow”的顺序是以下dNTP顺序的重复（参数可调）：

“TACG-TACG-TCTG-AGCA-TCGA-TCGA-TGTA-CAGC”

IonTorrent 测序记录“Ionograms”：

An “ionogram”代表信号的输出

必须“从上到下”和“从左向右”读

柱的高度代表在一个“Flow”中有几个核酸结合上去

“Negative ” 或 “zero” flows 代表没有核酸结合上去

IonTorrent实验流程汇总：

IonTorrent特点：

1.扩展性   :灵活高效的Ion Torrent

2.简捷：简单而又真实的生物化学原理

3.快速：最快速的 *** 作流程

IonTorrent应用与产品化：

提供快速鉴别与筛查食源性致病菌的整套工具

微生物全基因组测序— de novo 测序和重测序；

宏基因组测序（16S/18S…）—一项有效的工具；

RNA病毒测序：

1.纯化的RNA病毒分型

–病毒RNA抽提

–长PCR扩增子

–短PCR扩增子(利用AmpliSeq技术)

–TargetSeq捕获

2.未知的RNA病毒 denovo分析

–病毒RNA抽提

–反向富集，去除rRNA专有引物设计，去除宿主rRNA

Ion Total RNA-SeqKit (48 reactions)

•构建全外显子或Small RNA文库；

•维持原始单链并减少偏向性和错误；

•低起始量建库：总RNA 200ng或5ngmiRNA。

目标区域：

1.扩增子测序

基于PCR目标序列的深度测序，用于检测变异}扩增子的长度是可变的，

Ion Xpress™ 文库制备试剂盒与现有的Sanger测序法的引物完全兼容

利用barcoding试剂盒（条码试剂盒），可以实现多种样品的扩增子同时测序

检测生殖细胞和体细胞的突变

2.捕获目标序列 (目标序列>100kb)

通过杂交法或大量并行的PCR，实现目标序列的富集

•TargetSeq™定制富集试剂盒，可根据客户应用需求实现特定序列的富集

•可与其他富集方法兼容

Ion DNA 条码接头（Barcode Adaptor ）1-96试剂盒

1.Ion半导体测序技术采用优化的barcodes可以 一次进行多达96种文库的同时测序。

2.支持多种文库的目标序列或全基因组的再测序，可以降低成本，节省样品。

3. 最少的接头序列和强大的校正功能确保样品种类的确认

4. 兼容自动化 *** 作

微生物测序

准确，快速的细菌和病毒的从头测序和重测序

线粒体测序

多重线粒体测序用于科研，临床和法医等应用

扩增子测序

•多重扩增子测序用于快速的检测生殖细胞和体细胞的突变

•与毛细管电泳测序的引物完全兼容

•利用测序进行基因分型

•细菌和病毒的分型质粒测序

大片段目标序列（>100kb）的在测序

快速，简单的 *** 作流程适用于所有的大片段目标序列的富集方法

验证全基因组和显子组的突变

正交技术验证SOLiD®System/Illumina的全基因组和外显子组的测序结果

文库评估

在进行高通量的测序之前，对构建的文库进行快速的复杂性验证或QC质控

RNA测序

快速，简单的RNA测序解决方案（最初主要针对于小RNA&低复杂度的转录组）

IonTorrent数据处理：

Ion Torrent下机数据格式（SFF、BAM、Fastq）

默认下机文件类型为：BAM；

通过插件FastqCreator可下机直接生成：Fastq；

原始下机数据路径：

Fastq格式文件：/results/analysis/output/Home/（ReportName）/plugin_out/FileExporter_out.*

BAM格式文件：/results/analysis/output/Home/（ReportName）

IonTorrent测序质控：

Positive-controlKit，上机制备模板时加入；

可自行设置，占据上样量；

IonTorrent上机情况反馈

机器运行及分析的日志文件压缩包（Support文件）。

从本次课到第8次课，均是讲述DNA相关的知识。核酸的结构开始，到DNA如何组装为染色体，基因组学（5-6），DNA复制（7-8）。 学习该部分，希望同学们掌握描述DNA或是RNA时，常用的理化参数或者名词有哪些；还有就是关于核酸的常识。 当我们谈到核酸时，一般会关注GC含量、Tm值、大小（长度）。1). GC含量。 一个核酸分子中，鸟嘌呤和胞嘧啶所占的比率称为GC含量。在DNA中，GC含量愈高，DNA的密度也愈高；形成的双链愈稳定，因此热及碱不易使之变性。根据这一特性，可进行DNA的分离或测定。此外，对生物的基因组DNA来说，GC含量是一个固定值。2). Tm值。与此相关的是核酸的变性和复性。DNA在物理或化学因素作用下(如加热、酸碱或紫外线照射)，可以导致两条DNA链之间的氢键断裂，而核酸分子中的所有共价键(如磷酸二酯键、糖苷键等)则不受影响，称为DNA变性 (DNA denaturation or DNA melting)。凡能破坏双螺旋稳定的因素（如加热、极端的pH、有机试剂如甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等)均可引起核酸分子变性。比如，PCR中，会使用90度以上的高温让DNA变性；分析RNA时，会用65度进行RNA的变性；Southern blotting中，会用0.4N的NaOH对凝胶中电泳分离的DNA进行变性。 Tm值，就是让一半的DNA分子发生变性时的温度。DNA的Tm值由以下几个因素决定：（1）GC含量，在一定条件下Tm高低与DNA分子中的GC含量成正比，G-C含量高时，Tm值比较高，反之则低。这是因为G-C之间的氢键较A-T多，解链时需要较多的能量之故。（2）DNA长度。DNA所处的溶液条件，影响因素包括离子浓度、pH值和有机溶剂。 DNA复性。复性（renaturation），也称退火（annealing），就是两条单链DNA分子之间依据Waston-crick碱基互补配对的规则，变成双链的过程。复性的最佳温度一般在比Tm低25度左右。此外，如果将DNA高温变性后，立刻放在冰上降温，DNA会保持变性的单链状态，(称为淬火，quelling）。同DNA变性一样，影响DNA复性的因素包括：DNA浓度、复性的时间、DNA序列的复杂度等。鉴于DNA的复性的时间与DNA复杂度有关，因此可以通过用C0t值来描述DNA序列的复杂度。序列复杂度低，重复序列多，复性就快，C0t值低；复杂度高，复性慢，C0t就高。 DNA的变性和复性是许多实验的基础，比如PCR和分子杂交实验。例如我们在PCR中遇到高GC含量的模板时，DNA变性可能不完全，会利用一些添加剂来降低Tm值，提高PCR效率。这次课的作业就是与此有关。 另外就是经典的分子杂交实验。分子杂交：指两条单链核酸分子间复性变为为双链的过程。分子杂交技术，利用DNA变性、复性来检测核酸的技术。分子杂交可以发生在DNA单链之间，也可以是DNA单链和RNA之间，或者RNA之间都可以进行分子杂交。2）复性的两个DNA或RNA单链之间，序列可以不完全一致。比如DNA引物与模板之间有一个错配，实际上也能结合为部分双链（如DNA二级结构中的R型环突，R-loop）。3). DNA大小 。 核酸的大小主要用碱基对（base pair，bp）来表示。常用的单位有Kb (kilo base pairs)，Mb (mega base pairs)，Gb (giga base pairs) 等。在这部分中，需要了解C-值悖论。不同生物，基因组DNA的大小差异非常大，从只有几千bp的病毒到十亿以上碱基对的植物、动物。一般将单倍体基因组总DNA的含量可作为一个物种的特征，称为C值。按照常理推断，DNA的碱基多，携带的信息就多，基因的数目就多，能够完成的生命活动也会更复杂。在低等生物中的确存在这样的规律，一个物种的DNA多，往往编码的基因就多，能够适应更复杂的自然环境。但在真核生物中，DNA含量的和它编码基因的数目是没有严格的关联，和生物进化的复杂性也没有严格的对应关系。比如，青蛙的基因组是人的7倍；在植物种，拟南芥基因组只有100多Mb，水稻是400Mb左右，玉米和小麦是Gb以上，但这几种植物的复杂性、进化的程度，其实是等同的。这就引出了C值悖论（C-value paradox），即一个物种的C-值与它的进化没有严格的对应关系。 要完整的回答C-value paradox，可能等大家学完基因组学以及后面的课程，才能系统地解释出现C-值悖论地原因。简单的说，C-值大地物种中可能有大量的非编码DNA，还有就是大量的重复序列（如转座子），因此C值虽大，但并没有包含更多地基因（或是编码更多的蛋白）。那是不是这些非编码DNA和重复区域就是不需要的，是基因组上的“垃圾DNA”，这个问题不容易回答。我们在研究中确实发现有些DNA区域，或者一些有些不表达的重复基因，去掉以后对植物没什么影响。但大家回忆一下第一次课的小幽默。遗传学家将“安全带”去掉，正常情况对汽车的行驶不会由任何影响，只有在撞车时才会发现它是必要的。我们现在将某个基因或某段DNA去掉，并不能完全确定对植物没有影响，也许是在特定条件下才会出现；当然，有一些DNA的确就是“进化”的遗迹，是可以抛弃的。 DNA的一级结构是指各个核苷酸结构单元或碱基的排列顺序，存储了生物的遗传信息。此部分的重点是学习DNA测序的原理。1）Sanger测序最经典的是Sanger测序，也称链终止测序（chain termination method）。它利用DNA合成反应过程中，双脱氧核苷酸的加入使DNA链的合成终止，将终止的DNA链电泳后，来读取DNA序列。我们一般使用的是自动化sanger测序仪，用四种不同的荧光分子，分别标记ddATP、ddCTP，ddTTP和ddGTP。测序反应后，利用激光扫描仪直接读取荧光分子的颜色，获得碱基信息。（视频： https://v.youku.com/v_show/id_XMjk5ODA3ODc2MA==.html?spm=a2h0k.11417342.soresults.dtitle）2). 二代测序方法即使自动化的Sanger测序，在前期需要大量的准备工作，并且测序通量有限，一次电泳也只能进行384个片段的测序反应。2005 年 Roche 公司发布的 454 测序系统标志着测序技术跨人高通量并行测序的时代。第二代 DNA 测序（next generation sequencing，NGS）技术又称大量并行测序技术(massive parallel sequencing,MPS)、高通量测序技术(high—throughputsequencing,HTS)。 NGS其特点是一个反应能同时测定成千上万的DNA片段的序列，但读取序列的长度有限。最早只能读取几十个碱基对长度的小片段，到现在能够并行读取300-500bp的DNA片段的序列 。对于不同的测序技术，需要同学可以去查阅资料，到各个测序公司的官网了解这些测序方法的原理和性能。这里这是点到为止。焦磷酸测序（pyrosequencing）,  454测序仪 。 加入某一核苷酸时，检测DNA合成时是否产生PPi（焦磷酸）来判断碱基序列。 Illumina/Solexa测序：荧光标记和分子阵列。即在一张芯片上同时进行大量的类似Sanger的测序反应。由于使用的末端终止世纪时可逆的，在完成一个碱基的读取后，可持续进行DNA链的延伸和测序。 Ion Torrent测序（半导体测序）：利用半导体芯片捕获DNA合成过程中产生pH值的变化。3). 三代测序即单分子测序技术，在测序过程中不需要涉及PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测序。三代测序技术具有超长读长，还拥有不需要模板扩增、运行时间较短、直接检测表观修饰位点、较高的随机测序错误等特点。它弥补了第二代测序读长短、受GC含量影响大等局限性，已在小型基因组从头测序和组装中有较多应用。包括以下几个公司的技术。 Helicos （最早，2012年破产） OxfordNanopore 纳米孔测序（Nanopore） Pacific Biosciences的SMART测序，PacBio测序 DNA的二级结构主要是各种形式的双螺旋，除了最常见的B-型双螺旋，此外还有A-型双螺旋、Z-型双螺旋。B-型双螺旋也就是Watson和Crick提出的DNA结构模型，是生物体内DNA的主要形态。DNA还存在三链螺旋和四链螺旋。由于DNA的特殊性质，DNA可以组装成各种二级结构的纳米材料（DNA Origami）。我们感兴趣是有生物学意义的核酸结构。 在DNA复制， 转录，重组等阶段，双螺旋DNA还能形成多样的二级结构，比如分支型的DNA（在DNA修复中会出现），DNA复制时形成Y性的复制叉等 部分特殊的DNA序列哈能形成三螺旋DNA和四股螺旋DNA。三股螺旋DNA 四螺旋DNA ，也称G-quadruplex，在GGG重复序列组成的DNA链中容易形成的四螺旋DNA，发现于端粒、启动子等区域。近年研究发现G-quadruplex可能具有非常广泛的生物学功能，参与转录、翻译等环节的调控。         在细菌、病毒、真核细胞线粒体、叶绿体中，DNA多呈现双链环状分子，是没有自由末端的闭合双链结构（covalently closed circle DNA， cccDNA）。DNA分子可以在双螺旋的基础上，进一步绕同一中心轴扭转，造成额外的螺旋。形成超螺旋的结构。超螺旋本身具有方向性，因此当旋转方向不同时，可产生正超螺旋和负超螺旋两种形式的拓扑结构。右手超螺旋（顺时针），称为负超螺旋（与DNA双螺旋的旋转方向相反的扭转）；反之形成的左手超螺旋（逆时针）称为正超螺旋（与DNA双螺旋的旋转方向相同的扭转）。在生物体内，DNA主要以负超螺旋的形式存在，并通过拓扑异构酶来调整DNA的超螺旋结构。DNA超螺旋与DNA复制和转录都有关（可见DNA复制部分）。 真核生物染色体虽然是线性分子，但其DNA与蛋白质相互结合，以许多大环的形式存在，许多个环的基部聚合在一起形成类似环的结构。此外，真核生物DNA在细胞中高度压缩成染色体结构，在后面的章节中会介绍。3.5 RNA的二级结构RNA为单链，非常容易分子内或是分子间形成双链，进而形成各类二级结构。RNA的二级结构跟它的功能有密切联系，比如核糖体RNA、snoRNA、tRNA的二级结构，siRNA来源于双链RNA，miRNA来源于同一个RNA分子形成的stem-loop结构等。这节的另外一部分内容就是希望大家熟悉各类RNA相关的名词。

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