CRISPRCas9：精确编辑基因组的魔术剪刀？

1什么是基因剪刀呢？

研究发现，细菌有一种能力极强的免疫系统：当外来的病毒（噬菌体）感染细菌时，细菌就利用身体里的一种酶（Cas9）来切断外来病毒（噬菌体）的基因。这样，外来的病毒（噬菌体）不能在细菌身体里复制了（繁殖了），就相当于把病毒（噬菌体）间接杀死了，这样细菌就不会得病了。

根据这种现象，32岁的中国留美博士张锋（在美国麻省理工学院）发明了一种叫作CRISPR/Cas9的技术，也叫基因编辑技术，这种技术能对基因进行剪切，形成了一套基因编辑系统，或许将来人们治病可以选择“基因手术”。

我们知道，人生病大多是由于基因的关系。例如，人患癌症，大多是由于基因突变。如果用CRISPR/Cas9技术将机体里发生突变的基因剪切掉，植入健康的基因，人的癌症就会从根本上治愈。

2基因编辑研究引起“科研潮”

CRISPR/Cas9技术研究成功以后，世界各国几千个有关实验室都纷纷利用CRISPR/Cas9技术广泛地开展着方方面面的研究，掀起了一股基因编辑研究热潮。

例如，中国科学院昆明动物研究所的研究人员，利用基因编辑技术对两个品种的猴子进行基因改造（学术用语叫基因修饰）。经过基因修饰的猴子繁殖的后代，获得了两个基因靶向修饰的小猴子。这一研究工作引起了国外同行专家的特别关注，研究论文发表在美国《细胞》杂志上。

中国科学院遗传发育所的研究人员用该技术对水稻和小麦基因进行修饰改造，从事育种研究，获得成功。这一研究工作首次证实了CRISPR/Cas9技术能够用于植物的基因编辑。研究论文刊登在美国《自然生物技术》杂志上。

中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所的科研人员，用基因编辑技术治愈小白鼠的白内障遗传病。这一研究成果为疾病治疗开辟了新径。研究论文发表在美国《细胞·干细胞》杂志上。

3艾滋病也能被根治吗？

美国坦普尔大学神经科学研究院主任卡迈勒·哈利利教授和他的同事利用基因编辑技术，首次成功地从人类细胞中彻底清除了潜在的艾滋病病毒（HIV-1病毒）。该项研究成果发表在美国《国家科学院院刊》上。研究人员认为，这是朝着永久治愈艾滋病的方向迈出的重要一步。专家表示：“这是一项令人兴奋的发现，不过现在还没有准备进行临床试验，它只是证明了我们正朝着正确的方向前进。”

哈利利教授说，因为艾滋病病毒（HIV-1病毒）永远不会从人体的免疫系统消灭，只有用基因编辑技术彻底剪切病毒基因，才能根治艾滋病。

4修饰人体免疫细胞

据最新消息，美国加州大学旧金山分校的研究人员，已成功利用CRISPR/Cas9技术修饰了人体T细胞。

T细胞是免疫细胞，改造能使其升级更具杀伤力。如艾滋病病毒感染人体时，就是利用其表面的CXCR4蛋白来感染T细胞，使其丧失了杀伤力。修饰T细胞使其表面的CXCR4蛋白失去活性后，艾滋病病毒就不能感染T细胞了。

在癌症免疫疗法中，此基因编辑技术能成功关闭PD-1蛋白分子，进而诱导T细胞攻击肿瘤。该技术修饰改造T细胞，对治疗人体自身免疫疾病、癌症、艾滋病等都是一个新的思路。科学家非常看好此技术，T细胞在血液中循环，能到达很多病灶，也方便从患者体内采集，经编辑后再回输到患者体内，能更有针对性地治疗（此成果见美国《国家科学院院刊》2015年7月刊）。

这种CRISPR/Cas9基因剪刀技术，是一种简便、价廉、多功能、高效率的新技术，它也因此被誉为“基因组编辑的魔术手术刀”。

（本文出自《知识就是力量》杂志2015年9月刊《基因剪刀——基因组编辑的魔术手术刀》，作者：张树庸）

你是在mac系统中打开win7的文件夹吗？如果是这样的话只能复制。其他任何 *** 作都是无效的。你要创建文件夹，粘贴项目，必须进入到win7系统里面。
当然是可以的啦（我估计你是双系统），但是不在使用苹果系统的情况下无法新建，Macintosh HD是苹果系统的盘，开机按alt去苹果系统新建吧。

插入位点选择：Safe Harbour Sites，安全插入位点。
 组织特异性表达启动子

诱导型启动子：为Cre系统增加时间特异性
四环素系统（Tet-Off System / Tet-On System）
由四环素（tetracycline）或其衍生物多西环素（强力霉素Dox）控制转录激活子tTA或rtTA与启动子Ptet结合，从而调控下游基因的表达
Tet-Off / tTA依赖（tetracycline-controlled transactivator protein (tTA) dependent）
加药刺激后关闭启动子
Tet-ON / rtTA依赖（reverse tetracycline-controlled transactivator protein (rtTA) dependent）
加药刺激后开启启动子

他莫昔芬系统（Tamoxifen System）
Cre重组酶与突变的雌激素受体（ER）的配体结合域融合，形成Cre-ERT。Cre-ERT不再与它的天然配体β雌二醇结合，而与合成配体他莫昔芬结合。
不加他莫昔芬时，Cre-ERT融合蛋白分布于细胞质中并结合热激蛋白如Hsp90，抑制受体临近结构域的功能，复合体定位于细胞质中不能进入核。
加入他莫昔芬，Hsp90被从从ER中替换出来，ER受体转变为活性状态，暴露出核定位信号，Cre重组酶能进入核中并行使其功能。
Cas9：具有两个核酸内切酶结构域HNH和RuvC

PAM：protospacer adjacent motif SpCas9 PAM=NGG

相对结构： sgRNA互补链为Target被HNH剪切，非靶标链含有PAM序列被RuvC剪切

以SpCas9为例
D10A突变使RuvC结构域失活，仅切割靶链
0

H840A突变使HNH结构域失活，仅切割非目标链
2018 Sci Simultaneous lineage tracing and cell-type identification using CRISPR/Cas9-induced genetic scars
动物：斑马鱼zebrabow M(在所有细胞中具有32个表达RFP的位点)
方法：单细胞阶段向胚胎注射了2 nl Cas9蛋白和靶向RFP的sgRNA进行突变
2018 Sci Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR
动物+方法：生成了具有60个归巢向导RNA（hgRNA）的嵌合小鼠靶向其自身基因座导致多种突变结果。
2018 Sci Whole organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing
动物+方法：细胞中导入对应一个sgRNA的10个连续的Cas9靶区域。10个序列逐渐突变，与sgRNA亲和力逐渐减弱。
参考：

>用crisp/cas9制作转基因小鼠需要在胚胎上进行。

诱导性基因敲除也是以Cre/loxp系统为基础，但却是利用控制Cre表达的启动子的活性或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点，通过对诱导剂给予时间的控制或利用Cre基因定位表达系统中载体的宿主细胞特异性和将该表达系统转移到动物体内的过程在时间上的可控性，从而在1oxP动物的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行遗传修饰之目的的基因敲除技术。

需要实验小鼠的可以联系苏州赛业。赛业生物已服务全球数万名科学家，产品和技术已直接应用于包括CNS（Cell，Nature, Science）三大期刊在内的学术论文。除了提供基因敲除、基因敲入、条件性基因敲除模型定制服务外，赛业生物还有专业的手术疾病模型团队，可以提供多种复杂精细的小动物手术疾病模型；药物筛选评价小鼠平台可以提供从欧美行业领袖引进的免疫缺陷鼠、用于心血管及阿尔茨海默症等研究的人源化小鼠；国际标准化无菌鼠技术平台可以提供无菌鼠、无菌动物定制服务、微生物菌群移植服务等基于无菌动物模型的各类产品和服务，结合赛业生物成熟稳定的基因编辑小鼠平台，还可帮助您研究菌群与基因的互作机制。

哇塞！我终于搞定了，和你一样，我的这个方正F5580的扫描仪已经放了十几年了，确实是好的，但是就是除了XP，以上系统都不能用。最终解决办法：Windows10/8/7系统安装VMware虚拟机，在安装虚拟XP系统，这样就使用虚拟机XP了，安装驱动，就能用了！这已经是最好的办法了。

CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件[1]。
目前，来自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9 蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA 两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’），几乎可以在所有的基因中找 到大量靶点，因此得到广泛的应用。CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统[1]。
通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行 *** 作[2,3]。
目前常用的CAS9研究方法是通过普通质粒,质粒构建流程如下：
Cas9质粒构建
目前常见的CAS9普通质粒有（汉恒生物提供cas9质粒试剂盒）：
虽然普通质粒很多时候也能达到实验效果，但是质粒转染具有效率低，作用时间短暂性等缺点。病毒的出现解决了质粒这些问题，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用质粒见addgene（lentiCRISPR v2，lentiGuide-Puro，lentiCas9-Blast），慢病毒可以整合入宿主基因组中，长期稳定的表达（汉恒生物提供CRISPR/cas9 慢病毒包装），但是由于慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比较大（大于4kb），且长期插入可能导致乱切，脱靶等，同时慢病毒包装最终获得的滴度不高等原因，腺病毒更有优势，腺病毒克隆能力强，获得的病毒滴度也高。同时相对于普通质粒来说，作用是时间也比较长，可以达到更理想的敲除效果。

"公众对转基因担心的并不是基因技术，关键是转基因的“转”，现在通过基因测序研究已发展出基因编辑技术，可根据需要对原来的基因进行重新编辑，它可以不转任何新的基因，也能产生很好效果。中国今后将在进一步开展转基因研究的同时，积极推动基因编辑技术研究"。大妈连基因编辑都知道，真是厉害啊。既然提到这个，我就来科普一下啦。这个技术被Science期刊列为2013年十大突破中的第二位。导引RNA-Cas9系统是目前最简单有效的基因编辑方法。这个系统本身最初是受细菌抵抗噬菌体的启发。理论上你可以合成跟任何基因的DNA互补的导引RNA，这个RNA通过DNA-RNA序列互补（碱基配对），把核酸酶Cas9定位到目标基因，然后Cas9利用它的核酸酶活性把目标基因在特定的部位切断。之后，细胞自身的DNA损伤修复机制可以被用来改变目标基因Cas9切割点附近的DNA序列。这个系统可以用来选择性剔除某个基因，控制目标基因的转录活性，甚至有可能用来纠正导致遗传性疾病的突变基因。可是说到底，这个系统还是需要导入外源蛋白Cas9（最常用的是来自链球菌的Cas9)。另外，基因编辑只是对内源（原有）基因的修饰，而作物之所以需要转基因，常常是因为它们的内源基因里面没有包括编码某些有益性状的基因。如果要把内源的某个基因就地变成一个新的基因，即使技术上可以做到，带来的坏处也很可能超过好处（当然在特定条件下可能有例外），因为这个基因就会失去了原来该有的功能。当然，在有的情况下，可以利用基因编辑技术改变基因组里面某些基因的表达水平，就可以加强某些有益的性状和减弱某些有害性状。总之反转跟信教一样，是一种思维定式，基本上无解，不是技术手段可以解决的问题。

大家都知道CRISPR-Cas9有脱靶效应，并且每个sgRNA的效率都不一样的，因此在做正式实验之前，我们要验证sgRNA的效率，之后优中选优。还是那句话，同样的目的有很多不同的方案，我了解到的有：

欢迎大家补充，互相交流，提供更方便快捷的方案，由于我们实验室购买试剂盒时间长，相对困难，且sgRNA的切割效率的验证还是活细胞内效率最为准确。经过课题组师兄DZ的优化，一般我们针对一个基因的简单敲除，设计2个sgRNA即可，并且选择方案2进行验证。

接前期推文，我们做了一手漂亮的质粒转染后， 如何确定sgRNA切割活性，这条sgRNA到底还要不要，就看今天了 。

（1）293细胞转染

在转染前一天，将293细胞以单细胞分散状态种至6孔板中，组别设计为： 293未转染组（negative control），293转染组 。转染当天293细胞融合度为30 40%，将20 25 μg pSpCas9_sgRNA质粒使用lipofectamine 3000按照常规条件转染（具体细节请参照上期文章），72 h内进行下一步实验。

注意事项：由于293细胞贴壁不牢，很容易被吹落，因此在滴加转染试剂的时候要十分轻柔，换液时要更加小心沿壁加入，并且培养基要提前预温。

（2）提取293细胞基因组DNA

这里我们使用的是天根公司的基因组DNA提取试剂盒，严格按照试剂盒要求即可。

（3）使用高保真DNA聚合酶完成PCR实验

一定要使用高保真酶的原因是，T7 EI内切酶的原理是识别突变位点，所以如果使用的DNA聚合酶不够保真，在PCR过程扩增错误，引入突变，则会影响后续结果。 在这里需要提醒的是，任何DNA聚合酶的使用，一定要严格查阅相应说明书，确定实验条件 。我们使用的是NEB公司的Q5高保真DNA聚合酶，根据说明书指示，Q5 DNA聚合酶做的PCR实验，其primer的退火温度和普通我们使用的不一样，需要使用NEB公司的Tm calculator工具计算得出。

（4）胶回收PCR扩增出的目的序列
胶回收的原则就是，量大质优，严格按照说明书 *** 作即可。

（5）T7 Endonuclease I 酶切实验
配置实验反应

按照以下条件annealing

设置酶切反应后，37 ℃孵育15分钟

（6）琼脂糖凝胶电泳，预测分子量大小<1 kb，使用 15 2%琼脂糖；分子量大小为1 10 kb大小时，选用1-12%

（7）结果分析示例

CRISPR-Cas9基因编辑的直接敲除系列，今天写到这里算是完成了预实验部分。这个时候可以把整个方案的流程放在这里权当总结，并提示之后实验方向方向：

准备工作和预实验要至少得到以下简化的实验结果：

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