使用Linux版的MEGA构建某一基因家族的基因进化树

最近碰到了个需求，让我构建某一基因家族的进化树，并根据进化关系进行相应的分类。这让我想起了之前上课的时候，一个做进化的老师给我们讲过，如果不是纯做进化方向的课题，MEGA完全够用了。由于windows的内存等有限，做几十个基因还凑合，要是上百个基因就吃不消了，于是就想到了用Linux下的MEGA来做。

https://www.megasoftware.net/

由于是二进制文件，直接解压缩，添加到环境变量就可以用了。

具体请看我这篇文章。 https://www.jianshu.com/p/5fd60c818651

上一步我得到了该基因家族的所有基因家族的蛋白序列，然后我用windows下的MEGA的 muscle 算法进行了比较，【align-build alignment-上一步的基因家族蛋白序列-muscle比对-data-export-FASTA format】

最终我得到了比对后的 multiproteins.fasta 文件。

首先进行参数的解读，相比于其他软件，我觉得这款软件比较好理解，也容易上手。

这里的 .mao 文件尤为重要，较为简单的方法是拿到windows下去设置，具体请看组学大讲堂的这篇推送。

https://www.omicsclass.com/article/568

版本信息

MEGA version 10.1.8

For 64-bit Linux

Build 10200331

参数解读

EXAMPLES

This example performs a multiple sequence alignment on codons (it assumes that you have created the file "Clustal_Codon_Alignment.mao" using the prototyper (megaproto). A fasta file with coding data is used as input and the resulting alignment is output in the MEGA format:

This example shows how to construct a neighbor-joining phylogeny for each of a list of sequence data files.

The analysis will be performed for each file listed in "listOfDataFiles.txt" and all results will be written to

the ~/Documents/outputDirectory/ directory:

megacc -a ~/Documents/NJ_Tree_Settings.mao -l ~/Documents/listOfDataFiles.txt -o ~/Documents/outputDirectory/

LIST FORMAT

When using the -l option, each file to be analyzed must be on its own line. For example:

~/Documents/myData/seqData1.fas

~/Documents/myData/seqData2.fas

~/Documents/myData/seqData3.fas

If the analyses are to use a user-provided Newick tree file, then the tree files are given on the same line as the data files, following two pipe characters. For example:

~/Documents/myData/seqData1.fas || ~/Documents/myData/treeFile1.nwk

~/Documents/myData/seqData2.fas || ~/Documents/myData/treeFile2.nwk

~/Documents/myData/seqData3.fas || ~/Documents/myData/treeFile3.nwk

我的最终使用：

下一步我打算用 ggtree 来美化，具体学习情况，我再更新。

1. CIPRES网站：

CIPRES Science Gateway V 3.3 ： https://www.phylo.org/portal2/home.action#

2. 上传数据，选择RAXML tools

3. 设置参数

首先安装Linux版本RAxML

$ raxmlHPC ­-f a ­-x 12345 ­-p 12345 ­-# 100 ­-m PROTGAMMALGX ­-s example.phy ­-n ex -T 20

并行化软件支持，能最快速计算。并行化20个任务，每个任务使用8线程，能使用全部160线程计算资源：

$ /opt/sysoft/mpich2-1.5/bin/mpirun -np 20 raxmlHPC ­-f a ­-x 12345 ­-p 12345 ­-# 100 ­-m PROTGAMMALGX ­-s ex.phy ­-n ex -T 8

参数解读：

RAxML 的参数非常多，设置非常复杂，上述常用例子的参数为：

-f a

此参数用于选择 RAxML 运算的算法。可以设定的值非常之多。 a 表示执行快速 Bootstrap 分析并搜索最佳得分的 ML 树。

-x 12345

指定一个 int 数作为随机种子，以启用快速 Bootstrap 算法。

-p 12345

指定一个随机数作为 parsimony inferences 的种子。

-# 100

指定 bootstrap 的次数。

-m PROTGAMMALGX

指定核苷酸或氨基酸替代模型。PROTGAMMALGX 的解释： "PROT" 表示氨基酸替代模型； GAMMA 表示使用 GAMMA 模型； X 表示使用最大似然法估计碱基频率。

-s ex.phy

指定输入文件。phy 格式的多序列比对结果。软件包中包含一个程序来将 fasta 格式转换为 phy 格式。

-n ex

输出文件的后缀为 .ex 。

-T 20

指定多线程运行的 CPUs 。

RAxML_bootstrap.ex： 完整的全部bootstrapped trees

RAxML_bestTree.ex ： 最佳得分 ML 树

RAxML_bipartitions.ex  ： 有 bootstrap 分值支持的最佳得分树，分值在 node 上。

RAxML_bipartionsBranchLabels.ex ：   有 bootstrap 分值支持的最佳得分树, 分值在 branch 上。FigTree不能识别此文件。

说明：

-f a:  tell RAxML to conduct a rapid Bootstrap analysis and search for the best-scoring ML tree in one single program run. Example: raxmlHPC -f a -s alg -x 12345 -# 100 -m GTRCAT -n TEST.

f b:  when this is specified RAxML will draw the bipartitions using a bunch of topologies (typically bootstrapped trees) specified with -z (see below) onto a single tree topology specified by -t (typically the best-scoring ML tree). Example: raxmlHPC -f b -t ref -z trees -m GTRCAT -s alg -n TEST.

If you use -f a the tree file name RAxML_bipartions.[run_name] will be the best tree with bootstraps. For the f -b approach you first need to estimate a an optimal tree.

Figtree: 使用Figtree查看 RAxML_bipartions.ex 文件，可显示最佳得分树的bootstrap信息。

MEGA:   使用MEGA软件可得到压缩树condensed tree，打开 RAxML_bipartions.ex或者RAxML_bipartionsBranchLabels.ex  显示设定bootstrap阈值的condensed tree。

更多参数可参考：https://www.yuque.com/wusheng/gw7a9p/mcc73y

最近杂事真的非常的满，终于找到时间更新一下。。。。

通过上一篇文章的介绍， 系统发育树的基本概念 大家已经了解清楚，那到底怎么获得一棵可信的进化树呢？

对于群体遗传学分析，一般都会以群体SNPs位点数据构建系统发育树，因此，接下来我主要以SNPs数据为例，介绍系统进化树的构建方法。

序列比对->建树方法选择->计算最佳替代模型->进化树建立->进化树美化

常见的序列比对软件包括：Clustal和Muscle等。

Clustal 除了有自己独立的软件外（多种 *** 作系统都支持），也常被整合到一些常见的软件中，如：Bioedit、MEGA等。

Muscle 同样支持多种 *** 作系统。

两个软件的引用频率都很高，没有绝对的谁好谁坏，哪个顺手就用哪个即可。

1、Distance-based methods 距离法：

基于距离的方法：首先通过各个物种之间的比较，根据一定的假设（进化距离模型）推导得出分类群之间的进化距离，构建一个进化距离矩阵。进化树的构建则是基于这个矩阵中的进化距离关系。

2、Character-based methods 特征法：

基于特征的方法：不计算序列间的距离，而是将序列中有差异的位点作为单独的特征，并根据这些特征来建树。

模型选择的依据如下图：

UPGMA法已经较少使用。一般来讲，如果模型合适，ML的效果较好。对近缘序列，有人喜欢MP，因为用的假设最少。MP一般不用在远缘序列上，这时一般用NJ或ML。对相似度很低的序列，NJ往往会出现Long-branch attraction（LBA，长枝吸引现象），有时严重干扰进化树的构建。贝叶斯方法则太慢。对于各种方法构建分子进化树的准确性，有一篇综述 （Hall BG, 2005） 认为贝叶斯的方法最好，其次是ML，然后是MP。其实如果序列的相似性较高，各种方法都会得到不错的结果，模型间的差别也不大。不过现在文章普遍使用的是NJ是ML模型。

系统发育分析中，最大似然法（ML）和贝叶斯法（BI）是对替代模型非常敏感的两种算法，因此，利用ML法或BI法重建系统发育树前，替代模型的选择是必不可少的过程。

Win *** 作系统下jModeltest的使用方法参考这篇文章： 图解核苷酸替代模型的选择 - jModelTest 篇(By Raindy) 。

ProTest的使用方法可以参考这篇文章： 使用 ProtTest 来选择最优氨基酸替代模型 。

我自己基本都用的是Linux版本的jModelTest，使用及其简单，命令如下：

参数说明：

-d：输入文件。注意！这个软件需要输入的是.phy格式文件，不是.fasta格式。

-f：include models with unequals base frecuencies

-g：include models with rate variation among sites and number of categories

-i： include models with a proportion invariable sites

-s：number of substitution schemes

-v：do model averaging and parameter importances

-a：estimate model-averaged phylogeny for each active criterion

-BIC：calculate the Bayesian Information Criterion

-AIC：calculate the Akaike Information Criterion

结果的最下方，有如图所示的列举，也就是得分最高的模型。

计算完最佳模型，我们就要开始建树了。对于ML树的构建，推荐大家使用新一代RAxML——raxml-ng。

RAxML一直是ML建树的经典工具，其由来自德国海德堡理论科学研究所（Heidelberg Institute for Theoretical Studies）的Alexandros Stamatakis开发。近年来，其江湖地位也受到来自其他软件，尤其是IQ-Tree的挑战。Zhou等人的文章 Evaluating Fast Maximum Likelihood-Based Phylogenetic Programs Using Empirical Phylogenomic Data set 对RAxML，IQ-TREE，FastTree，Phyml四个最大似然法建树软件的实际效果和表现进行了系统比较，其中一个结论是IQTREE在准确性方面要略胜一筹。

近日，RAxML的升级版， raxml-ng 发布！

相较于上一代，raxml-ng有如下优势：

话不多说，直接建树：

参数说明：

--all：Perform an all-in-one analysis (ML tree search + non-parametric bootstrap)

--msa：对其后的序列文件

--model：直接输入上一步产生的最佳模型

--bs-trees：检查树的鲁棒性（robustness）进行自展（bootstrap）检验，进行1000次bootstrapping抽样

--threads：给定线程

运行后结果如下图所示，其中.bestTree就是我们要的树文件，导入树可视化工具即可（我比较常用MEGA和 iTOL ）,下次再写一下如何美化进化树吧。

做进化分析的工友们可能都有个感觉，很多分析一等就是好几天，特别是建树（做过的都知道其中的痛苦），有时候忽然加入一个样品又要从头来。因此，一台给力的服务器是必要的工具。比如，上文提到了SNP进化树，我做的还仅仅只是相近物种，而且基因组很小（9M），SNP位点就有4万个，如果要用我MEGA这些软件调用我电脑8核的CPU，1000自展值可能要跑到毕业。

生物学背景出身的我，抄着那一点可怜的计算机常识，在我们课题组购买服务器时，我做了非常多的功课。当然，主要还是听取公司技术人员的建议，通过我非常非常非常长时间的测试，多次使用常见的生物信息分析软件（我主要从事寄生虫基因组、宿主转录组、16S宏基因组等研究），最终，找到了一个性价比超高的服务器配置，具体配置如下：

真心感谢一下烽伟的技术小哥哥们，乐死不疲的回答我各种低级的问题，如果有啥需要可以联系一下他们的技术，感觉蛮靠谱哒，官网： 烽伟科技 。

上一个他们的LOGO，以表感谢。

本文为本人的学习笔记，希望对大家有所帮助。本文大量参考网络文章，文章来源列举于全文末尾。

参考：

一文读懂进化树

使用 ProtTest 来选择最优氨基酸替代模型

RAxML进化树构建的新一代——raxml-ng

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