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抽滤,混合液渗入后,胡萝卜素从吸附柱上全部排出,叶黄素与叶绿素a分开,并逐渐被洗脱下来。 *** 作步骤
1.色素的提取
称取绿色组织2g,弃去粗大叶脉后剪成碎块,放在干净的研钵内,加入少量碳酸钙和石英砂,以及少量丙酮(干材料用85%丙酮,新鲜材料用无水丙酮),研磨成匀浆。减压过滤,滤液收集于量筒中,残渣再用丙酮洗涤数次,直至无色,定容20ml。提取液经反射光照射应观察到血红色荧光。
丙酮提取液中不仅有叶绿体的色素,而且也有能溶于丙酮中的化合物,为了更好地分离色素,必须用石油醚纯化色素。
纯化色素时将丙酮提取液转入分液漏斗中,加等量石油醚,轻轻摇动,再加等量饱和NaCl溶液振摇,再加等量蒸馏水振摇,放置分层。待明显分为两层,上层为深绿色石油醚层,有显著的荧光性。小心地把下面的丙酮水液层放掉,用洗瓶沿漏斗壁以水洗涤石油醚层6─7次,以彻底洗去丙酮。定容为20ml,所得石油醚色素提取液置于棕色瓶中待用。
2.吸附柱的制备
(1) 干法装柱
把层析柱的玻管部分固定在抽滤瓶上,在玻管的基部用清洁的脱脂棉填上,使松紧合适,于其上放一大小合适的圆形滤纸片,柱的上端放一小漏斗,取烘过的蔗糖粉由小漏斗装入柱中,边装边轻敲柱外壁,随后进行抽气,使蔗糖柱紧实,约为15cm长。
装好吸附剂后于其上轻轻盖上一片大小合适的圆形滤纸,小心地注入石油醚,抽滤,当蔗糖柱全部被石油醚浸湿,且在柱上面留有少量石油醚时,停止抽吸。
(2) 湿法装柱
层析柱用夹子垂直固定于铁架上,下端套上一段乳胶管,在乳管的另一端套上一玻璃管,在乳胶管上夹一螺旋夹,以控制流速。柱子下端同样填上脱脂棉,放上小滤纸片,柱上放一小漏斗。先关闭螺旋夹,注入一定体积的石油醚于柱中,打开螺旋夹,让石油醚以每秒1滴的流速流下,当注入的石油醚流至柱的3/4处,从小漏斗缓缓装入蔗糖粉,抽吸,并在蔗糖柱上盖一滤纸片,待石油醚快流完时,停止抽吸。
3.色素的分离
将色素提取液2ml倾入吸附柱上,当色素提取液将要全部进入蔗糖柱中,加入一定体积的石油醚冲洗,抽吸,至柱上的颜色快要扩展到吸附柱的下端时,就在柱上出现不同颜色的色带,上面是黄绿色的叶绿素b,其次是蓝绿色的叶绿素a,再下面是的叶黄素,胡萝卜素没有被蔗糖吸附,出现在柱的最下端或随洗脱剂石油醚进入抽滤瓶中。
4.色素的洗脱
分布在柱上各色带的位置彼此很接近,为了更好地分离,需将各色带分开有较大的距离。
为此可加入10─15ml汽油—苯的混合液)(10∶1),抽滤,混合液渗入后,胡萝卜素从吸附柱上全部排出,叶黄素与叶绿素a分开,并逐渐被洗脱下来。这时再加入汽油—苯的混合液(1∶2),抽滤,叶绿a和叶绿素b更清楚地分开,叶绿素a被洗脱,叶绿素b可用乙醚(或乙醇)洗脱。
注:为了更好地观察叶绿体的4种主要色素,可在柱子的最下端装入中性氧化铝,约占柱长的1/5,上面再装蔗糖,制成吸附剂的混合柱,这样从上到下为叶绿素b,叶绿素a,叶黄素和胡罗卜素,4种色素会很好地分离。
回答于 2022-12-01
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