Ion Torrent 基因分析仪——介绍及原理

IonTorrent基因分析仪组件：

IonTorrent与Illumina原理的主要区别：

Illumina：荧光信号

Ion Torrent：电信号

IonTorrent 核心理念：

核心理念：芯片就是测序仪

特点：扩展性、简捷、快速

半导体测序技术：

IonTorrent生物化学原理：

IonTorrent如何快速、直接检测：

Ion系列测序平台适用的chips及数据产出情况汇总：

PGM Chip：

314 Chip：1.2M Wells

316 Chip：6.1M Wells

318 Chip：11M Wells

Ion torrent测序过程：

Follow 和Cycle的含义：

一个“Follow”：将一个特定的dNTP(T, A, C, or G)打入芯片，随后进行洗脱；

一个“Cycle”：是由4个dNTP组成，例如：A-T-C-G= 1 Cycle。

测序时“Follow”的顺序是怎样的？

“Flow”的顺序是以下dNTP顺序的重复（参数可调）：

“TACG-TACG-TCTG-AGCA-TCGA-TCGA-TGTA-CAGC”

IonTorrent 测序记录“Ionograms”：

An “ionogram”代表信号的输出

必须“从上到下”和“从左向右”读

柱的高度代表在一个“Flow”中有几个核酸结合上去

“Negative ” 或 “zero” flows 代表没有核酸结合上去

IonTorrent实验流程汇总：

IonTorrent特点：

1.扩展性   :灵活高效的Ion Torrent

2.简捷：简单而又真实的生物化学原理

3.快速：最快速的 *** 作流程

IonTorrent应用与产品化：

提供快速鉴别与筛查食源性致病菌的整套工具

微生物全基因组测序— de novo 测序和重测序；

宏基因组测序（16S/18S…）—一项有效的工具；

RNA病毒测序：

1.纯化的RNA病毒分型

–病毒RNA抽提

–长PCR扩增子

–短PCR扩增子(利用AmpliSeq技术)

–TargetSeq捕获

2.未知的RNA病毒 denovo分析

–病毒RNA抽提

–反向富集，去除rRNA专有引物设计，去除宿主rRNA

Ion Total RNA-SeqKit (48 reactions)

•构建全外显子或Small RNA文库；

•维持原始单链并减少偏向性和错误；

•低起始量建库：总RNA 200ng或5ngmiRNA。

目标区域：

1.扩增子测序

基于PCR目标序列的深度测序，用于检测变异}扩增子的长度是可变的，

Ion Xpress™ 文库制备试剂盒与现有的Sanger测序法的引物完全兼容

利用barcoding试剂盒（条码试剂盒），可以实现多种样品的扩增子同时测序

检测生殖细胞和体细胞的突变

2.捕获目标序列 (目标序列>100kb)

通过杂交法或大量并行的PCR，实现目标序列的富集

•TargetSeq™定制富集试剂盒，可根据客户应用需求实现特定序列的富集

•可与其他富集方法兼容

Ion DNA 条码接头（Barcode Adaptor ）1-96试剂盒

1.Ion半导体测序技术采用优化的barcodes可以 一次进行多达96种文库的同时测序。

2.支持多种文库的目标序列或全基因组的再测序，可以降低成本，节省样品。

3. 最少的接头序列和强大的校正功能确保样品种类的确认

4. 兼容自动化 *** 作

微生物测序

准确，快速的细菌和病毒的从头测序和重测序

线粒体测序

多重线粒体测序用于科研，临床和法医等应用

扩增子测序

•多重扩增子测序用于快速的检测生殖细胞和体细胞的突变

•与毛细管电泳测序的引物完全兼容

•利用测序进行基因分型

•细菌和病毒的分型质粒测序

大片段目标序列（>100kb）的在测序

快速，简单的 *** 作流程适用于所有的大片段目标序列的富集方法

验证全基因组和显子组的突变

正交技术验证SOLiD®System/Illumina的全基因组和外显子组的测序结果

文库评估

在进行高通量的测序之前，对构建的文库进行快速的复杂性验证或QC质控

RNA测序

快速，简单的RNA测序解决方案（最初主要针对于小RNA&低复杂度的转录组）

IonTorrent数据处理：

Ion Torrent下机数据格式（SFF、BAM、Fastq）

默认下机文件类型为：BAM；

通过插件FastqCreator可下机直接生成：Fastq；

原始下机数据路径：

Fastq格式文件：/results/analysis/output/Home/（ReportName）/plugin_out/FileExporter_out.*

BAM格式文件：/results/analysis/output/Home/（ReportName）

IonTorrent测序质控：

Positive-controlKit，上机制备模板时加入；

可自行设置，占据上样量；

IonTorrent上机情况反馈

机器运行及分析的日志文件压缩包（Support文件）。

Illumina公司的Solexa测序平台，目前主流的型号的HiSeq-2500，以及Hiseq-2000，数据通量在每张Flow cell 300G数据，每次最多可以上2张Flow cell，单张Flow cell运行时间大约在11天左右。读长通常是100BP，据说近期有了长度上的突破。还有一个型号是MiSeq，该机器运行通量较小，但是读长大约在150BP以上，常用于微生物检测，而且该型号获得FDA认证，可以进行临床样本的检测。Solexa的错误类型主要是颠换。

罗氏454平台，主要特点是测序长度很长，目前大于1K的测序没有什么难度了，比较适合基因组测序，用于搭建基因组框架，也常用于微生物基因组测序。该平台主要的错误类型是插入缺失。

ABI的SoLID平台，听说该平台不在维护了，故而不再描述。

Life的Ion torrent平台，目前主要有2种型号，较早的一个型号是PGM，该测序仪原理类似于454测序，与454不同的是，454是化学反应发光进行检测，而PGM是半导体测序，检测H离子，如果发生了碱基互补配对，那么高能磷酸键就会释放H离子，导致电位变化，从而根据已知加入的碱基，就可以判断待测序列是否与已知加入的碱基发生互补，从而达到测序目的，测序长度可以达到400BP，主要用于微生物的检测，错误类型也是插入缺失错误。最新的型号是IonProton，该机器与PGM测序原理一致，但是测序通量由PGM的1G数据上升至10G数据，测序精度也较PGM有大幅度提升，测序时间大约是1天。

PacBio的单分子三代测序，该测序仪最大的特点就是测序长度比454更长，更加有利于基因组的拼接工作，有些较小的微生物可以直接将基因组测通成环状。

什么测序仪，现在主要的测序有一代二代三代，一代测序主要原理就是sanger测序法，也叫双脱氧末端终止法，二代测序主要是illumina 的边合成边测序的方法，还有life的H变化导致的ph变化的半导体芯片法，三代测序主要是长链测序，但错误率较高，比较少用，主要是单分子测序法。

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