罗氏454平台,主要特点是测序长度很长,目前大于1K的测序没有什么难度了,比较适合基因组测序,用于搭建基因组框架,也常用于微生物基因组测序。该平台主要的错误类型是插入缺失。
ABI的SoLID平台,听说该平台不在维护了,故而不再描述。
Life的Ion torrent平台,目前主要有2种型号,较早的一个型号是PGM,该测序仪原理类似于454测序,与454不同的是,454是化学反应发光进行检测,而PGM是半导体测序,检测H离子,如果发生了碱基互补配对,那么高能磷酸键就会释放H离子,导致电位变化,从而根据已知加入的碱基,就可以判断待测序列是否与已知加入的碱基发生互补,从而达到测序目的,测序长度可以达到400BP,主要用于微生物的检测,错误类型也是插入缺失错误。最新的型号是IonProton,该机器与PGM测序原理一致,但是测序通量由PGM的1G数据上升至10G数据,测序精度也较PGM有大幅度提升,测序时间大约是1天。
PacBio的单分子三代测序,该测序仪最大的特点就是测序长度比454更长,更加有利于基因组的拼接工作,有些较小的微生物可以直接将基因组测通成环状。
第二代测序技术又称为下一代测序(NGS),与第一代相比主要是1.高通量测序2.边合成边测序。回顾二代测序的发展史
1996年Ronaghi和Uhlen发明了焦磷酸测序,454 Life sciences 公司基于此原理推出了测序系统Genome Sequencer 20System,标志着二代测序的商用;
2006和07年 Solexa和ABI公司推出了GA SOLID测序平台
2010年Life Technologies 推出Ion PGM系统
2014年华大推出了BGISEQ-1000
1.Illumina/Solexa测序平台
之前也总结过Illumina测序的原理,现简要梗概一下其步骤
1)DNA文库准备:先将DNA链打断成200-500bp的片段,末端修复后在两端连上特异性的接头
2)流动槽杂交:
带有接头的DNA片段流过流通池,与其上固定的种接头通过互补配对结合。这些固定的接头其后充当引物的作用,在聚合酶的作用下进行合成反应。
3)DNA合成后,变性使得未与流动池共价连接的DNA链解离并洗掉,反向练则以共价键结合在流动池的表面。因为DNA单链另一端也含有接头,能够和临近的接头互补,DNA链形成桥式结构,同样的这个相邻的接头充当引物,在DNA聚合酶的作用下, 合成双链桥式结构。重复此过程,形成5000-10000个copy。这个目的是形成序列相同的DNA簇,使得在测序的过程中产生足够强的信号。变性打开,各自形成单链的DNA链固定在表面。将反向链切除,将正向链的的3‘封闭,以免产生不必要的DNA延伸。
4)DNA测序:加入测序引物,DNA聚合酶,4种带不同荧光标记的dNTP,且这些dNTPde3’端羟基被封闭,无法继续下一个反应。计算机检测到荧光的信号后,将不同的信号转化为对应的碱基。加入化学试剂淬灭信号,并去除3’的保护基团,并进行下一个碱基的反应。
illumina测序一般能够检测150个碱基左右,因为在后续,由于DNA合成酶活力下降等原因,造成相同序列的DNA信号不一致,DNA测序的准确性下降。
在实际的测序过程中,通常一次性会测不同物种来源的DNA,此时,需要barcode来进行标记。不同的物种带有不同的barcode序列,在DNA测序完成后,需要加入barcode引物,将barcode也进行测序。
该测序系统基半导体测序原理,不需要进行光学感应。
原理简要概括如下:
在测序的过程中,识别不同的碱基不是依靠荧光信号,而是通过dNTP结合释放的H+。
更多的信息详见 7种测序平台 - Thinkando - 博客园 (cnblogs.com)
补充:
罗氏454测序
罗氏454的焦磷酸测序是最早发行的二代测序。其测序的文库的建立和Ion Torrent相似,一个磁珠吸附一个模板DNA,充当一个微型的反应器。外面裹以油,将不同的液滴隔离开来。不同的片段平行扩增,待反应结束后,破坏乳液,只剩下磁珠。此时一个磁珠=一条读长。
将磁珠放在PTP板中测序,依次加入ATCG四种碱基。让碱基能够成功配对时,会释放一个焦磷酸。
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