Ion Torrent 基因分析仪——介绍及原理

IonTorrent与Illumina原理的主要区别：

Illumina：荧光信号

Ion Torrent：电信号

IonTorrent 核心理念：

核心理念：芯片就是测序仪

特点：扩展性、简捷、快速

半导体测序技术：

IonTorrent生物化学原理：

IonTorrent如何快速、直接检测：

Ion系列测序平台适用的chips及数据产出情况汇总：

PGM Chip：

314 Chip：1.2M Wells

316 Chip：6.1M Wells

318 Chip：11M Wells

Ion torrent测序过程：

Follow 和Cycle的含义：

一个“Follow”：将一个特定的dNTP(T, A, C, or G)打入芯片，随后进行洗脱；

一个“Cycle”：是由4个dNTP组成，例如：A-T-C-G= 1 Cycle。

测序时“Follow”的顺序是怎样的？

“Flow”的顺序是以下dNTP顺序的重复（参数可调）：

“TACG-TACG-TCTG-AGCA-TCGA-TCGA-TGTA-CAGC”

IonTorrent 测序记录“Ionograms”：

An “ionogram”代表信号的输出

必须“从上到下”和“从左向右”读

柱的高度代表在一个“Flow”中有几个核酸结合上去

“Negative ” 或 “zero” flows 代表没有核酸结合上去

IonTorrent实验流程汇总：

IonTorrent特点：

1.扩展性   :灵活高效的Ion Torrent

2.简捷：简单而又真实的生物化学原理

3.快速：最快速的 *** 作流程

IonTorrent应用与产品化：

提供快速鉴别与筛查食源性致病菌的整套工具

微生物全基因组测序— de novo 测序和重测序；

宏基因组测序（16S/18S…）—一项有效的工具；

RNA病毒测序：

1.纯化的RNA病毒分型

–病毒RNA抽提

–长PCR扩增子

–短PCR扩增子(利用AmpliSeq技术)

–TargetSeq捕获

2.未知的RNA病毒 denovo分析

–病毒RNA抽提

–反向富集，去除rRNA专有引物设计，去除宿主rRNA

Ion Total RNA-SeqKit (48 reactions)

•构建全外显子或Small RNA文库；

•维持原始单链并减少偏向性和错误；

•低起始量建库：总RNA 200ng或5ngmiRNA。

目标区域：

1.扩增子测序

基于PCR目标序列的深度测序，用于检测变异}扩增子的长度是可变的，

Ion Xpress™ 文库制备试剂盒与现有的Sanger测序法的引物完全兼容

利用barcoding试剂盒（条码试剂盒），可以实现多种样品的扩增子同时测序

检测生殖细胞和体细胞的突变

2.捕获目标序列 (目标序列>100kb)

通过杂交法或大量并行的PCR，实现目标序列的富集

•TargetSeq™定制富集试剂盒，可根据客户应用需求实现特定序列的富集

•可与其他富集方法兼容

Ion DNA 条码接头（Barcode Adaptor ）1-96试剂盒

1.Ion半导体测序技术采用优化的barcodes可以 一次进行多达96种文库的同时测序。

2.支持多种文库的目标序列或全基因组的再测序，可以降低成本，节省样品。

3. 最少的接头序列和强大的校正功能确保样品种类的确认

4. 兼容自动化 *** 作

微生物测序

准确，快速的细菌和病毒的从头测序和重测序

线粒体测序

多重线粒体测序用于科研，临床和法医等应用

扩增子测序

•多重扩增子测序用于快速的检测生殖细胞和体细胞的突变

•与毛细管电泳测序的引物完全兼容

•利用测序进行基因分型

•细菌和病毒的分型质粒测序

大片段目标序列（>100kb）的在测序

快速，简单的 *** 作流程适用于所有的大片段目标序列的富集方法

验证全基因组和显子组的突变

正交技术验证SOLiD®System/Illumina的全基因组和外显子组的测序结果

文库评估

在进行高通量的测序之前，对构建的文库进行快速的复杂性验证或QC质控

RNA测序

快速，简单的RNA测序解决方案（最初主要针对于小RNA&低复杂度的转录组）

IonTorrent数据处理：

Ion Torrent下机数据格式（SFF、BAM、Fastq）

默认下机文件类型为：BAM；

通过插件FastqCreator可下机直接生成：Fastq；

原始下机数据路径：

Fastq格式文件：/results/analysis/output/Home/（ReportName）/plugin_out/FileExporter_out.*

BAM格式文件：/results/analysis/output/Home/（ReportName）

IonTorrent测序质控：

Positive-controlKit，上机制备模板时加入；

可自行设置，占据上样量；

IonTorrent上机情况反馈

机器运行及分析的日志文件压缩包（Support文件）。

到底选择什么材料来做掺杂，有几个方面的考虑：

（1）原子的重量（AtomMass）。掺杂一般是有两种工艺：扩散（diffusion）和离子注入（ionimplantation）。所谓扩散，就是把掺杂原子直接跟单晶硅表面接触，再加上热能的辅助，杂质原子会扩散到硅晶体里面。但是，不同的原子，扩散系数（diffusioncoefficient）是不同的。笼统而言：原子质量越高的，扩散系数会更低，也难扩散到比较深远的位置。而离子注入所能到达的深度，更是跟原子质量息息相关。原子质量越大，越需要高能加速，才能注入到更深的区域。但副作用就是，原子质量越大，加速的能量越高，会对单晶硅造成更严重的晶格损伤（Latticedamage）。如果单晶硅被打成筛子，就成了多晶硅了（armophous），其光学特性和电学特性都会改变。所以，在离子注入之后，一般需要高温煺火（thermalannealing）。高温煺火作用有二：(i)修复晶格损伤，(ii)激活（thermalactivation）掺杂原子的自由电子（或空穴）。这个煺火温度肯定要低于硅的熔点，否则硅片都成液态了。但即便如此，如果latticedamage过于严重，煺火不见得能完全修复。

（2）激活能量(ActivationEnergy)。掺杂的原子进入单晶硅取代硅原子的位置，还需要煺火处理，来激活自由电子（空穴），从而改变半导体材料的导电性。不同的掺杂原子，其电子（空穴），从禁带（bandgap）里面的能级跃迁到导带（conductionband，对应电子）或者价带（valenceband，对应空穴），所需要提供的能量差是不一样的。具体的数值，我记得在半导体物理类的参考书里面有一个表格可以查到。这个能量差越大，需要煺火的温度越高。而集成电路制造，一定是有thermalbudget的，即，不能用太高的温度（+太长的煺火时间），否则会影响之前其他工艺流程所达到的参数。

所以，选择什么元素做掺杂，一定是个综合考量的过程。比如，希望在小区域内形成高浓度掺杂，用离子注入，低能量，重掺杂原子，效果会好。而希望在大的区域内形成比较均匀的低浓度掺杂，用扩散，轻一些的掺杂原子，更能达到目的。