QIIME中做16srDNA测序数据分析out_tablleBMP.biom文件如何生成？

步骤如下：

1. 在Linux系统中（或虚拟系统）通过cd命令进入文件夹（路径）；

2. 用FLASH工具：flash subsample_r1.fq subsample_r2.fq -m 200 -M 280 -o merged

3.提取barcode： extract_barcodes.py -f joined.extendedFrags.fastq -c barcode_single_end --bc1_len 6 -o processed_seqs

4. 割库：split_libraries.py -m mapping.txt -b 10 -l 250 -f merged.extendedFrags.fastq_fasta -o split_library_out

5. OTU分类：pick_otus.py -i split_library_out/chimera_filtered_seqs.fna -o picked_otus/

到这里就可以得到biom文件了

6. 得到分类信息：biom summarize-table -i sorted_otu_table.biom -o seqs_per_sample.txt

三、质量控制

该步骤的质量控制主要包括三个方面：去除嵌合体、去除单一序列、去除非细菌序列和叶绿体序列。

1、去除嵌合体序列

去除嵌合体序列主要包括：嵌合体序列的确定、从序列文件中删除嵌合体和从OTU table中删除嵌合体。

（1）嵌合体序列的确定：

QIIME中提供了identify_chimeric_seqs.py命令以确定嵌合体，方法主要有ChimeraSlayer和USEARCH 6.1两种，但是，经尝试，速度均很慢，所以可以直接使用Mother中UCHIME方法确定嵌合体。使用上面第三步得到的Alignment序列，进行嵌合体确定，嵌合体序列被记录在.accnos文件中，将文件后缀改为.txt得到chimeraID.txt文件。

（2）从序列文件中删除嵌合体

-s选项为只包含序列名的文件（例如上步得到的chimeraID.txt），加上-n选项表示从序列文件中删去该文件中出现的序列，不加-n选项则表示只保留这部分序列。

（3）从OTU table中删除嵌合体

两种方法可以实现：

一是重新生成新的OTU table，在上面第七步make_otu_table.py中加入去除嵌合体的选项：

二是在第七步得到的OTU table中删除：

2、去除单一序列：

单一序列（Singleton）是指在所有测序结果中只包含一条序列的OTU，针对OTU table *** 作同样使用filter_otus_from_otu_table.py命令进行去除：

3、去除非细菌序列和叶绿体序列：

根据进化分类的信息，仅保留细菌序列，同时去除叶绿体序列，使用filter_taxa_from_otu_table.py命令 *** 作：

其中-p选项为仅保留，-n选项为去除，注意k和c后面为连续两条下划线。

当然，2、3两步只是针对OTU table进行处理，如果需要针对.fasta序列文件删除该部分序列，可以通过filter_fasta.py结合OTU table的biom文件实现：

这样得到的序列文件就可以重新进行上面第二项中的5、6两小步，即对齐、剪切、建树。

四、Biom格式的OTU table *** 作

经过质控后，我们最终得到了OTU table，这是下游分析的基础。

（1）Biom格式的OTU table描述：

执行该命令可以得到OTU table的一些基本信息，包括各样品包含的序列条数等。

（2）为方便后续使用其他软件进行统计分析，需要将Biom格式OTU table转化为.txt的文本格式：

1.创建工作目录，工作目录下存放公司处理过的 cleandata 和 mapping.txt

2.使用 validate_mapping_file.py 验证 mapping.txt 格式是否正确

在文件管理中找到该.html文件，双击打开

由于是 cleandata，故不需要填写 barcode 和 prime 信息

3.使用 split_libraries_fastq.py 切分数据（主要目的：得到seqs.fna）

4.使用 pick_otus.py 进行OTU聚类

5.使用 pick_rep.set.py 选择代表性OTU序列

6.使用 align_seqs.py 进行多序列比对

7.使用 filter_alignment.py 过滤比对结果

8.使用 make_phylogeny.py 构建进化树

9.使用 assign_taxonomy.py 进行物种分类注释

10.使用 make_otu_table.py 生成 OTUs table

11.使用 biom convert 将转换biom文件格式为txt格式

12.使用 biom convert 统计 otu_table.biom

13.处理 OTU table

1）按mapping文件顺序排序

2）过滤 OTU 数量大于1

3）删除异常样品

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