infusion同源部分包括酶切位点序列吗

在传统的分子克隆中，我们经常通过PCR技术扩增得到目的基因后，先构建T-A克隆载体，将基因在大肠杆菌中进行扩增，然后酶切阳性T-A载体和目标载体，最后进行目的基因和目的载体的连接。这个过程大概需要1-2周来完成，而且具有很大的局限性，主要表现在：1、载体多克隆位点和基因内部酶切位点的局限性；2、基因克隆过程中需要添加酶切位点，可能会带入非特异性扩增；3、对于长片段与目标载体的连接效果差；4、无法实现大规模载体的构建。

IN-FUSION技术主要来源于INFUSION酶的发现，（如图）INFUSION酶能够识别线性化的DNA片段5’-3’末端任意16碱基，使其形成粘性末端。目标质粒通过酶切或者PCR线性化后，也能被INFUSION酶识别。只需要载体和基因形成的粘性末端互补，通过退火的过程就能完成载体的构建。IN-FUSION技术相比于传统酶切连接技术优点在于：1、摆脱了酶切位点的束缚；2、连接效率高，构建周期短，为普通酶切连接体系的200-500倍；3、对3000bp以上的基因载体构建成功率高；4、适用于大规模载体构建。

图1：IN-FUSION技术流程

云克隆对原有的IN-FUSION技术进行改进优化

它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。

in-fusion克隆试剂盒的组分如下。

1、纯化用试剂CloningEnhancer。

2、纯化用Column，NucleoSpin。

3、高效感受态Stellar，CompetentCell。

4、高保真PCR酶CloneAmp，HiFiPCR，Premix。

5、In-Fusion是Takara推出的新一代无缝克隆试剂。

---