PCR实验方法步骤

PCR实验方法步骤,第1张

PCR在分子克隆和DNA分析中有多种用途,下面小编就向大家介绍PCR实验方法步骤:

方法

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在冰浴中,按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

10×PCR buffer

5 μl     dNTP mix (2mM)

4 μl     引物1(10pM)

2 μl     引物2(10pM)

2 μl     Taq酶 (2U/μl)

1 μl     DNA模板(50ng-1μg/μl)

1 μl      加ddH2O至 50 μl

视PCR仪有无热盖,不加或添乎敬加石蜡油。

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调整好反应程序。将上述混合液稍加腔型离心,立即置PCR仪上,执行扩增。一般:在93℃预变性3-5min,进入循环扩增阶段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循环30-35次,最后在72℃ 保温7min。

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结束反应,PCR产物放置于4℃待电伍顷猜泳检测或-20℃长期保存。

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PCR的电泳检测:如在反应管中加有石蜡油,需用100μl氯仿进行抽提反应混合液,以除去石蜡油;否则,直接取5-10μl电泳检测。

END

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PCR即聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)的缩写,它是体外酶促合成特异DNA片段的方法。这一灶蠢消方法的要点是合成两个分别互补于待扩增DNA片段隐知两端的小片段引物,在含有引物、待扩增DNA模板核苷酸底物和DNA多聚酶的反应体系中DNA复制反复进行,在短时间内可以取得大量扩增产物。其原理是寡聚核苷酸链引物在DNA聚合酶的作用下沿模板延伸,合成两个与靶DNA两侧序列互补的引物,在体外进行靶DNA的重复合成。

主要的技术步骤是:

(1)DNA变性 加热使靶DNA序列双链解离成单链DNA。

(2)引物与靶DNA退火 适当降低温度,使两个引物分别结合成靶DNA两条的3′末端向5′末端延伸。

(3)引物延伸 在DNA聚合酶的催化下,引物档罩沿着靶DNA3′末端向5′末端延伸。新合成的DNA链在变性解离后,又可作为模板与引物杂交,并且在DNA聚合酶的催化下,引导合成新的靶DNA链。如此反复进行以上3个步骤,即可使靶DNA片段指数性扩增。


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