荧光定量pcr标准曲线怎么计算

采用相对法定量要求必须目的基因和内参具有相同的扩增效率,所以需要做efficiency

curve如果得到的斜率小于01,可以采用相对法,否则,需要重新设计能达到相同扩增效率的引物,或者就需要制作标准曲线,制作标准曲线,可以将基因片段克隆到质粒,然后体外转录成RNA,定量以后合成cDNA,然后按比例稀释后做出标准曲线,或者可以采用一个一直质量好的RNA样品,如细胞株,然后以此为标准制作如果直接采用DNA做标准,那前提是RNA逆转录的效率一致

但实际上在计算IC50 的同时，我们一般也要标准曲线，还要线性方程。所以还是用Origin 来拟合标准曲线，然后用origin 内置功能来计算IC50 比较方便。这里使用Origin75 来作演示。1 先随意输入一组数据吧2 选中这2 列数据，然后点左下角的作scatter 图的图标，3 然后就生成了散点图4 点击Analysis 菜单中的Fit Polynomial，在d出的对话框中，Order 处设为1，这样就是作线性拟合，就是勾选对话框中的Show Flormula on graph。（可能Origin 的设计者认为线性拟合公式太简单，默认就不用显示了）5 点击OK 后，就得到了拟合后的图形。线性方程公式也显示在了图形上。注意窗口的右下角。点击那里的小箭头后，我们可以看到完整的拟合统计信息，如相关系数R2=099186 好了，标准曲线知道了，现在就来计算IC50。根据IC50 定义，该例子中就是Y 取中值时，X 对应的数值，这里Y 的中值是06，那根据线性方程就可以自己算出来对应的X 值。那如果不是线性方程，公式比较复杂手工计算就很麻烦了，所以还是用Origin 中的功能吧。点击Tools，Linear Fit， 如果不是线性拟合的，请选择其他拟合方式，如果是S 形曲线的，则需要选择Sigmoidal Fit7 在d出的对话框中，先点击Fit，然后在Find Y 处输入06，点击Find X 按钮，得到的数值就是IC50了。

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