17-思路清奇：纯生信分析表观基因组学和形态学ITH的比较空间分析

肺腺癌（ADC）是肺癌中最普遍的亚型，占所有病例的46％以上。在分子层面上，ADC的特征是具有复杂的基因组格局。最近的研究集中在深入了解基因组和表观基因组改变的后果以及肿瘤异质性在治疗反应和治疗抵抗中的作用。ADC组织病理学生长模式的分析显示广泛的肿瘤内异质性（ITH）。值得注意的是，尽管在许多情况下发现了多种组织学，但主要的组织形态学生长模式（鳞状，腺泡，乳头状，微乳头状，实体状）具有很高的预后性和预测性。在分子水平上，研究发现驱动程序突变等位基因频率与组织学生长模式之间具有高度相关性。在表观基因组水平上，第一项研究报道了肺ADC中DNA甲基化模式的高肿瘤内异质性。但是，到目前为止，尚未进行ADC中表观基因组学和形态学ITH的比较空间分析。

那么今天我为大家带来这篇文章作者系统地评估了来自七个主要ADC的122个肿瘤的形态生长模式，以评估组织学亚型的空间分布。

（1）患者和样本：作者根据2015年WHO肺癌分类标准（表1），对7位II至IV期ADC患者的肿瘤（n = 27）和非肿瘤（n = 7）组织标本进行了评估。对其中四名患者的六个淋巴结转移进行了类似的评估。病理学家将最大直径的肿瘤切片分为5 x 5 mm的区域并在连续的H&E染色切片上确定每个节段的主要组织学生长模式（定义为百分比最高的模式）。在这七名患者​​中，四名携带KRAS基因突变，三名携带TP53（其中两个是双重突变）。

（2）DNA提取和定量：将来自每个片段的六个连续的未染色的10 µm组织切片去石蜡并用蛋白酶K消化。使用LEV DNA纯化试剂盒进行DNA提取。使用Qubit HS DNA分析确定DNA浓度。

（3）Digital PCR：使用Quantstudio 3D Digital PCR系统利用20 ng模板DNA分析了患者4淋巴结中激活的KRAS G12S突变的存在，并验证了TaqMan SNP基因分型分析。

（4）全局甲基化谱：应用Infinium MethylationEPIC BeadChip 来评估> 866,000 CpG位点的全基因组DNA甲基化水平。在DKFZ基因组学和蛋白质组学核心设施中，对来自恶性和正常肺FFPE组织样本的500ng基因组DNA进行亚硫酸氢盐转化并进行甲基化分析。

（5）DNA甲基化数据分析：使用“minfi”R包处理原始甲基化数据。正常样本的甲基化定义为七个匹配的非肿瘤性肺组织样品的平均甲基化。

（6）基因组注释：通过标准的Illumina Infinium甲基化EPIC BeadChip标准进行CpG注释。

（7）无监督分层聚类：使用肿瘤内甲基化差异最大的10,000个探针的β值，进行甲基化水平的无监督分层聚类。聚类采用欧氏距离和平均连锁作为聚类方法。

（8）拷贝数分析：使用R包“conumee”从甲基化和未甲基化的探针信号强度值得出拷贝数分布图。

（9）系统发生树重建：根据肿瘤内甲基化变异的距离矩阵来推断系统发生的关系。使用具有最大肿瘤内甲基化差异的10,000个探针的Beta值来计算DNA甲基化欧几里德距离矩阵。最后使用R包“ape”来构建系统发生树。

（10）差异甲基化分析：使用线性模型来评估肿瘤和肺肿瘤组织中的甲基化差异。使用PANTHER分类系统对差异甲基化基因进行了GO和KEGG分析。

（11）相关性分析：应用Pearson相关系数来估计基于甲基化的距离。

1  ADC的组织学和表观基因组分析： 为了对组织病理学肿瘤内异质性进行系统表征，作者将7位ADC患者的中央肿瘤切片（表1）解剖为122个肿瘤和34个5 x 5 mm的非肿瘤部分。

靠近转录起始位点（TSSs）的DNA甲基化影响基因活性。为了确定TSS活性，作者将active 和 passive的TSS的甲基化水平与正常肺组织的H3 K4Me3标记进行了比较。结果显示具有K4Me3标记的潜在passive TSS在其TSS周围的1kb区域显示甲基化水平降低，而没有K4Me3标记的位点显示甲基化水平较高（图1 A）。

并且与passive TSS相比，活性（active）位点总体上甲基化水平较低（图1 B）：具有K4Me3标记的active TSS处的CpGs显示平均甲基化水平为005至01，而没有激活组蛋白标记的passive TSS显示平均甲基化水平> 05。接下来作者比较了非肿瘤组织的平均甲基化水平与患者2的两个腺泡，鳞状，乳头状和实心部分的甲基化。揭示了肿瘤内和组织内的异质性（图1C）。

2  DNA甲基化分析揭示了广泛的肿瘤内异质性： 在这一部分作者对不同节段和淋巴结转移之间的DNA甲基化模式进行单独评估，发现DNA甲基化具有广泛的肿瘤内异质性，并通过无监督分层聚类来显示结果（图2A）。此外，对患者所有节段的分析进一步说明了同一肿瘤各节段之间的强烈变异性（图2 B）。

为了将异质性程度放在更广泛的背景下，作者对来自TCGA肺腺癌的33个肿瘤区段的启动子区域和369例患者（366个肿瘤和38个正常样品）的相应位点进行了12601个位点的无监督分层聚类。结果显示这些样本没有形成单独的群集，并且个体内的区段彼此之间的相似性仍然不与来自不同个体的区段相似（图3）。

3  拷贝数变异的异质性： 为了更深入地了解拷贝数变异（CNV）的空间分布，作者基于EPIC阵列数据确定了每个区段的CNV分布图。结果在33个肿瘤区段中的32个中鉴定了具有体细胞拷贝数增减的CNV（图4A）。总体而言，CNV图谱在肿瘤内部比在肿瘤之间更相似。仅患者4的淋巴结转移未显示出具有与匹配的非肿瘤组织相似的特征的CNV。接下来作者基于TCGA数据进一步确定了在肺ADC和潜在的肿瘤驱动CNVs中被鉴定为反复扩增或缺失的基因的拷贝数状态。这项分析表明尽管所有片段均携带至少一个重复扩增或缺失的基因的CNV，却发现了克隆和亚克隆拷贝数得失的片段之间的空间异质性（图4 B）。

4  基于CNV和DNA甲基化数据的生长模式的克隆进化： 为了深入了解ADC的克隆进化并探索淋巴结转移的组织学起源，作者根据DNA甲基化变化和CNV得出的距离矩阵对40个多区域片段进行了系统发育重建。结果作者在表观遗传水平上观察到ADC的分支进化，在原发肿瘤的生长模式之间具有广泛的克隆多样性（图5 A）。甚至同一增长模式的各个部分也显示出分支演化，表明同一模式在不同区域或不同时间点独立出现（图4 B）。为了进一步探索不同肿瘤区域之间的亚克隆关系不受选择性限制或生态位适应的影响，作者对远离调控元件的基因组位点（n = 83,756）进行了相关分析。相关性证实了肿瘤内的亚克隆关系和广泛变化（图5B）。

为了重建组织形态学模式的克隆进化，本研究对27个原发性肿瘤区域，7个匹配的正常组织和7个ADC病例的6个淋巴结转移进行了整体DNA甲基化分析。结果表明，表观基因组特征的广泛变化有助于原发性ADC和淋巴结转移的分子和表型异质性。

16-IF4+:非肿瘤的疾病挖掘 利用WGCNA分析挖掘孕前BMI和新生儿体重的关键基因

18-IF6+:纯生信分析甲基化和基因表达整合鉴定三阴性乳腺癌的预后标志物和药物靶标

19-干细胞、分子靶向治疗和EMT生物过程联合构建多发性脑瘤预后模型

20-基于全基因组分析探索MAPK失调与免疫应答的关系

本书主要讨论KMDF，KMDF是WDM的继续，可以把WDM驱动程序转换为KMDF驱动程序。还对UMDF设备驱动程序作了编程入门介绍。

过去，我研究过如何用DriverStudio开发工具开发Windows下的WDM设备驱动程序，承蒙电子工业出版社的厚爱，出版了《Windows 2000/XP WDM设备驱动程序开发》一书。

WDF的简单化编程，导致DriverStudio退出了Windows设备驱动程序的开发，将DriverStudio定格在32版本。

从形式上看，KMDF的对象和DriverStudio的类，具有相似的地方。本书的内容安排和《Windows 2000/XP WDM设备驱动程序开发》的基本一致，具体安排如下：

章 名 主 要 内 容

第1章 Windows 2000和WDM驱动程序 KMDF是WDM的继续，KMDF构建在WDM之上。对于一些Windows驱动程序的基本概念，初学者仍需要了解，如Windows 2000中的组件、驱动程序种类，以及WDM驱动程序特点等

第2章 KMDF驱动程序框架 KMDF驱动程序框架由对象和事件回调例程构成。KMDF框架中所有的事物都由对象来表示，各种事件处理都由事件回调例程来完成。学习KMDF编程，主要是学习KMDF的各种对象、对象函数和事件回调例程的编程

第3章 基本对象 KMDF提供了许多对象，本章只介绍一些基本的对象，如WDFREQUEST对象、WDFQUEUE对象等，还介绍了数据同步访问、字符串 *** 作和QueueSample实例

第4章 KMDF驱动程序编程入门 介绍Windows Vista下的KMDF驱动程序编程入门，包括KMDF驱动程序编程环境的建立，KMDF的创建、生成及安装过程，以及Win32 Console和MFC两种应用程序的编程

第5章 KMDF驱动程序和应用程序之间的通信 介绍应用程序与KMDF之间的通信，包括应用程序对KMDF的通信，以及KMDF对应用程序的通信

第6章 即插即用例程 主要介绍PnP组件、即插即用例程的加载和卸载顺序及PnpPowerSample实例等

第7章 电源管理 主要介绍系统电源状态与设备电源状态、电源管理控制标志位、设备的唤醒特征和空闲检测、电源管理编程及IdleSample实例等

第8章 KMDF过滤器驱动程序 描述如何写一个过滤器驱动程序，该驱动程序可位于功能驱动程序的上面或下面，它通过过滤流经它的IRP来修改设备的行为

第9章 USB设备开发 主要介绍USB设备的配置/接口/端点、USB数据的传输方式、USB描述符、USB编程对象、USB编程（如激活配置与中止配置、同步 *** 作、异步 *** 作）及USBSample实例等

第10章 PCI设备驱动程序开发 本章就硬件访问、中断处理和DMA传输3个方面展开讨论，并以CY7C09449芯片为例，给出一个经过测试的PCI设备驱动程序实例——PCISample实例。另外，还给出了一个不依靠硬件设备的DMASample实例

第11章 UMDF驱动程序编程入门 介绍UMDF驱动程序编程入门，包括UMDF驱动程序的创建、生成及安装，以及一个简单的实例编程

第12章 WinDbg使用介绍 WinDbg是微软提供的一个功能非常强大的调试软件，可以在源代码级别调试Windows下的WDF驱动程序。本章主要介绍用WinDbg调试KMDF和UMDF

微软推荐的WDF书籍是《Developing Drivers with the Microsoft Windows Driver Foundation》，作者是Penny Orwick和Guy Smith。

微软提供的学习WDF的中文网站地址是：>

1、设置声音相关属性，首先进入控制面板——声音选项，在播放选项卡的下面应该会有扬声器这样的设备，双击打开属性窗口，在级别选项卡中，要保持喇叭状的按钮为正常状态，如下图所示：

2、同样，如果是麦克风没声音的情况，就进入录制选项卡中的级别一栏，保持声音样的图标为正常状态。

3、检查声卡驱动是否有问题，右键单击开始菜单的计算机选项，选择属性，进入设备管理器，查看声音、视频和游戏控制器一项中是否有带有**或红色叹号的项，如有过，请尝试更新声卡驱动(可下载驱动精灵自动更新)。

4、检查Win7的声音服务是否被禁用，右键单击开始菜单中的计算机一项，选择管理，进入服务选项中，找到Windows Audio一项确保其保持启动状态。

在学习之前一直对驱动开发非常的陌生，感觉有点神秘。不知道驱动开发和普通的程序开发究竟有什么不同；它的基本框架又是什么样的；他的开发环境有什么特殊的地方；以及怎么写编写一个简单的字符设备驱动前编译加载，下面我就对这些问题一个一个的介绍。

一、驱动的基本框架

1．  那么究竟什么是驱动程序，它有什么用呢:

l     驱动是硬件设备与应用程序之间的一个中间软件层

l 它使得某个特定硬件能够响应一个定义良好的内部编程接口，同时完全隐蔽了设备的工作细节

l     用户通过一组与具体设备无关的标准化的调用来完成相应的 *** 作

l 驱动程序的任务就是把这些标准化的系统调用映射到具体设备对于实际硬件的特定 *** 作上

l     驱动程序是内核的一部分，可以使用中断、DMA等 *** 作

l     驱动程序在用户态和内核态之间传递数据

2．  Linux驱动的基本框架

3．  Linux下设备驱动程序的一般可以分为以下三类

1)        字符设备

a)         所有能够象字节流一样访问的设备都通过字符设备来实现

b)        它们被映射为文件系统中的节点，通常在/dev/目录下面

c)        一般要包含open read write close等系统调用的实现

2)        块设备

d)        通常是指诸如磁盘、内存、Flash等可以容纳文件系统的存储设备。

e)         块设备也是通过文件系统来访问，与字符设备的区别是：内核管理数据的方式不同

f)         它允许象字符设备一样以字节流的方式来访问，也可一次传递任意多的字节。

3)        网络接口设备

g)        通常它指的是硬件设备，但有时也可能是一个软件设备(如回环接口loopback)，它们由内核中网络子系统驱动，负责发送和接收数据包。

h)        它们的数据传送往往不是面向流的，因此很难将它们映射到一个文件系统的节点上。

二、怎么搭建一个驱动的开发环境

因为驱动是要编译进内核,在启动内核时就会驱动此硬件设备；或者编译生成一个o文件, 当应用程序需要时再动态加载进内核空间运行。因此编译任何一个驱动程序都要链接到内核的源码树。所以搭建环境的第一步当然是建内核源码树

1       怎么建内核源码树

a) 首先看你的系统有没有源码树，在你的/lib/ modules目录下会有内核信息，比如我当前的系统里有两个版本：

#ls /lib/ modules

2615-rc7  2621-13194fc7

查看其源码位置:

## ll /lib/modules/2615-rc7/build

lrwxrwxrwx 1 root root 27 2008-04-28 19:19 /lib/modules/2615-rc7/build -> /root/xkli/linux-2615-rc7

发现build是一个链接文件，其所对应的目录就是源码树的目录。但现在这里目标目录已经是无效的了。所以得自己重新下载

b)下载并编译源码树

有很多网站上可以下载，但官方网址是：

>

下载完后当然就是解压编译了

# tar –xzvf linux-261654targz

#cd linux-261654

## make menuconfig (配置内核各选项,如果没有配置就无法下一步编译，这里可以不要改任何东西)

#make

…

如果编译没有出错。那么恭喜你。你的开发环境已经搭建好了

三、了解驱动的基本知识

1         设备号

1)        什么是设备号呢？我们进系统根据现有的设备来讲解就清楚了：

#ls -l /dev/

crwxrwxrwx 1 root root     1,   3 2009-05-11 16:36 null

crw------- 1 root root     4,   0 2009-05-11 16:35 systty

crw-rw-rw- 1 root tty      5,   0 2009-05-11 16:36 tty

crw-rw---- 1 root tty      4,   0 2009-05-11 16:35 tty0

在日期前面的两个数（如第一列就是1,3）就是表示的设备号，第一个是主设备号，第二个是从设备号

2)        设备号有什么用呢？

l 传统上, 主编号标识设备相连的驱动 例如, /dev/null 和 /dev/zero 都由驱动 1 来管理, 而虚拟控制台和串口终端都由驱动 4 管理

l 次编号被内核用来决定引用哪个设备 依据你的驱动是如何编写的自己区别

3)        设备号结构类型以及申请方式

l   在内核中, dev_t 类型(在 中定义)用来持有设备编号, 对于 260 内核, dev_t 是 32 位的量, 12 位用作主编号, 20 位用作次编号

l   能获得一个 dev_t 的主或者次编号方式：

MAJOR(dev_t dev); //主要

MINOR(dev_t dev);//次要

l   但是如果你有主次编号, 需要将其转换为一个 dev_t, 使用: MKDEV(int major, int minor);

4)        怎么在程序中分配和释放设备号

在建立一个字符驱动时需要做的第一件事是获取一个或多个设备编号来使用 可以达到此功能的函数有两个：

l       一个是你自己事先知道设备号的

register_chrdev_region, 在 中声明:

int register_chrdev_region(dev_t first, unsigned int count, char name);

first 是你要分配的起始设备编号 first 的次编号部分常常是 0,count 是你请求的连续设备编号的总数 name 是应当连接到这个编号范围的设备的名子; 它会出现在 /proc/devices 和 sysfs 中

l       第二个是动态动态分配设备编号

int alloc_chrdev_region(dev_t dev, unsigned int firstminor, unsigned int count, char name);

使用这个函数, dev 是一个只输出的参数, 它在函数成功完成时持有你的分配范围的第一个数 fisetminor 应当是请求的第一个要用的次编号; 它常常是 0 count 和 name 参数如同给 request_chrdev_region 的一样

5)        设备编号的释放使用

不管你是采用哪些方式分配的设备号。使用之后肯定是要释放的，其方式如下：

void unregister_chrdev_region(dev_t first, unsigned int count);

6)

2         驱动程序的二个最重要数据结构

1)         file_operation

倒如字符设备scull的一般定义如下：

struct file_operations scull_fops = {

owner =  THIS_MODULE, 

 llseek =  scull_llseek, 

 read =  scull_read, 

 write =  scull_write, 

 ioctl =  scull_ioctl, 

 open =  scull_open, 

 release =  scull_release,  

};

file_operation也称为设备驱动程序接口

定义在 , 是一个函数指针的集合 每个打开文件(内部用一个 file 结构来代表)与它自身的函数集合相关连( 通过包含一个称为 f_op 的成员, 它指向一个 file_operations 结构) 这些 *** 作大部分负责实现系统调用, 因此, 命名为 open, read, 等等

2)         File

定义位于include/fsh

struct file结构与驱动相关的成员

l         mode_t f_mode      标识文件的读写权限

l         loff_t f_pos           当前读写位置

l         unsigned int_f_flag 文件标志，主要进行阻塞/非阻塞型 *** 作时检查

l         struct file_operation f_op  文件 *** 作的结构指针

l         void private_data 驱动程序一般将它指向已经分配的数据

l         struct dentry f_dentry  文件对应的目录项结构

3         字符设备注册

1)        内核在内部使用类型 struct cdev 的结构来代表字符设备 在内核调用你的设备 *** 作前, 必须编写分配并注册一个或几个这些结构 有 2 种方法来分配和初始化一个这些结构

l             如果你想在运行时获得一个独立的 cdev 结构,可以这样使用:

struct cdev my_cdev = cdev_alloc();

my_cdev->ops = &my_fops;

l             如果想将 cdev 结构嵌入一个你自己的设备特定的结构; 你应当初始化你已经分配的结构, 使用:

void cdev_init(struct cdev cdev, struct file_operations fops);

2)        一旦 cdev 结构建立, 最后的步骤是把它告诉内核, 调用:

int cdev_add(struct cdev dev, dev_t num, unsigned int count);

说明：dev 是 cdev 结构, num 是这个设备响应的第一个设备号, count 是应当关联到设备的设备号的数目 常常 count 是 1, 但是有多个设备号对应于一个特定的设备的情形

3)        为从系统去除一个字符设备, 调用:

void cdev_del(struct cdev dev);

4         open 和 release

一般的驱动程序是不允许应用程序调用的，只有当驱动程序留出这种供外界访问的接口才行，这种接口一般包括read，write，open，ioctl等接口，如果驱动中预留出了这些接口，就可以在应用程序中调用，比如fd=open(设备，参数);或者fd=ioctl(设备，参数);，这样就会调用到这个设备驱动中的open或者ioctl函数。所以一般如果想再应用程序中调试某个驱动程序，常见的方法就是自己建立一个驱动模块，这个模块中预留出对外接口，比如ioctl。然后在你新建的这个驱动模块中完成ioctl函数，如下：

int device_ioctl(fd,argv) {

/ your function; /

}

static struct file_operations device = {

ioctl = device_ioctl //预留外部接口

};

应用程序如下：

ioctl（device，argv）；

上面这句就可以完成你的模块中ioctl中的功能。

我估计你的这个课题是在ARM这个硬件平台上实现的，所以你需要了解一些ARM的东西，当然Linux的话，也需要看，APUE虽然好，但是有点厚，有点难，看你的时间不多了，我就推荐你一本也很经典的书：Unix\Linux编程实践教程，看完这个，其实你对linux编程会入门了，如果这时再看APUE的话，会很简单。

数据逆向可以分为不同的级别，其中包括低级别、中级别和高级别。

低级别的数据逆向主要是通过简单的技术手段对数据进行解密、解码或解压缩，并破解软件的加密机制，例如逆向工程和破解软件注册码等。这种级别的数据逆向对技术要求较低，只需要基本的编程和计算机知识即可实现。

中级别的数据逆向需要具备更高级的技术要求，需要对程序代码进行深入分析，并掌握复杂的加密算法和协议。这种级别的数据逆向常常用于安全评估和漏洞挖掘领域，例如反作弊系统的破解和网络安全的攻防对抗等。

高级别的数据逆向则需要具备极高的技术水平，需要针对硬件设备进行逆向分析，并对 *** 作系统、内核和驱动程序进行深入研究。这种级别的数据逆向通常应用于安全研究、数字取证和恶意代码分析等复杂领域，并对技术人员的能力和经验提出了更高的要求。

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