Nature Nanotech | 靶向脂质纳米颗粒的普适性指导原则

近年来，mRNA依赖的蛋白质替换和CRISPR/Cas介导的基因编辑/修复在多种疾病治疗方面有着极大的应用价值，但是体内安全、高效的递送是制约其应用的最大障碍 1-4 。由于制备过程简易和可以重复给药的特点，非病毒纳米颗粒展现出了非常好的应用前景 1 ，其中 脂质纳米粒 （Lipid Nanoparticles， LNPs ）在RNA治疗中成绩最为突出，2018年8月，FDA批准的第一款siRNA药物（Onpattro）正是基于MC3 LNPs的递送技术 5 。与siRNA药物相似，当前mRNA和CRISPR/Cas的递送LNPs大多数是肝脏靶向的，肝脏以外的有效递送问题亟待解决。高通量化学合成和筛选的方法可以得到靶向肝脏以外的LNPs，如肺和脾 6-8 ，但此方法工作量大、耗时长、并且具有一定的盲目性，而且很难真正给出具有普适性的LNPs设计原则。

2020年4月6日，来自德克萨斯大学西南医学中心 Daniel J Siegwart 教授团队（共同一作为 程强 和 魏妥 博士）在 Nature Nanotechnology 上在线发表了题目为“ Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR–Cas gene editing ”的研究成果，报道了器官选择性mRNA递送和CRISPR/Cas基因编辑的研究成果，提出了对靶向递送LNPs的普适性设计原则（ SORT ）。 SORT可以对LNPs进行精准地、可预测地优化，使其快速实现肝、肺和脾的mRNA靶向递送和CRISPR/Cas9介导的基因编辑（图1），预计该结果将会极大程度地推动mRNA治疗和基因编辑领域的发展，尤其是肝脏以外的靶向治疗。

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图1 SORT技术实现了mRNA的器官选择性递送。

该实验室的前期研究结果表明，两性（同时带有正、负电荷）脂质组成的LNPs会非特异递送mRNA到达多种器官中（肝、肺） 6 ；另一研究结果显示通过调整脂质体的表面电荷可以递送mRNA到免疫细胞中（肺、脾）从而介导肿瘤的免疫治疗 9 。基于此，作者猜想LNPs内部的电荷平衡可能是调控器官选择性递送的关键，为了验证该想法，作者选择了该实验室已优化的肝靶向递送LNPs（名为mDLNP） 10 为研究对象，在原有的4组分中引入带有电荷的第5种脂质（SORT脂质）以便调节LNPs内部的电荷。首先选择了最为常用的阳离子DOTAP脂质分子，随后构建了一系列不同组成比例的DOTAP mDLNP，通用公式为5A2-SC8/DOPE/Chol/PEG/DOTAP=15/15/30/3/X，这里X的变化使得DOTAP含量可以从0%到100%。接着，作者通过静脉给药在小鼠内体进行了mRNA的递送研究。

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图2 DOTAP在mDLNP中占的比例决定了mRNA的器官选择性递送。

通过静脉注射低剂量（01mg/kg）荧光素酶mRNA（Luc mRNA）的纳米颗粒后，DOTAP mDLNP成功转染了小鼠体内的脏器。令人惊讶的是，随着DOTAP的比例不同，表现出了器官选择性mRNA的递送效果（图2）。0%为肝脏特异性转染、10%-15%为脾脏转染最高、之后随着DOTAP比例越高，肺部靶向性越好，且50% DOTAP呈现出最好的肺部转染效果。鉴于此结果，作者随后用相同的策略研究了阴离子SORT脂质（18PA）对mRNA的影响，结果显示引入5%到40%的18PA mDLNP特异性递送mRNA到了脾脏（图3），而在肝和肺没有检测到任何荧光素酶的表达。这些结果表明，LNPs的内部电荷的确在器官选择性递送中扮演了重要的角色。作者将这种快速筛选器官选择性LNPs的方法命名为 SORT 。

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图3 阴离子18PA脂质改造后的mDLNP实现了脾脏的特异性mRNA递送。

为了验证SORT的普适性，首先，利用相同的策略研究了其他类型的LNPs，作者选择了MC3 LNPs 11 和C12-200 LNPs 12 ，二者均为肝靶向mRNA递送载体的金标准。分别引入DOTAP和18PA脂质以后，均得到了与mDLNP中完全一致的结果，即控制DOTAP的比例使mRNA递送到脾和肺，而18PA的加入成功实现了脾脏的特异性mRNA递送（图4），这些结果说明SORT适用于任何类型的LNPs。值得一提的是，MC3 LNPs已经是FDA批准的siRNA递送载体，通过SORT优化技术，有可能对MC3 LNPs进行快速、高效的改造，从而加速siRNA或者mRNA在肺和脾中的治疗应用；接着，作者尝试了多种不同结构但电荷相同的SORT脂质分子以证明其普适性，阳离子脂质分别使用了DOTAP、DDAB和EPC，阴离子脂质使用了18PA、14PA和18BMP，最终得到了一致的结论。说明，SORT技术不依赖脂质分子的化学结构，而是LNPs内部电荷的平衡；最后，作者尝试把SORT脂质替换为可离子化的阳离子脂质，如，DODAP，C12-200和5A2-SC8分子，这些分子在中性环境中不带有任何电荷，而在酸性条件下可带正电荷。研究结果表明，可离子化的阳离子脂质不会改变器官的选择性递送，依然具有肝脏特异性，但是通过引入20%的SORT脂质显著提高了肝脏的转染效率。至此，作者证明了SORT技术在LNPs优化中的普适性规律，简言之，阳离子SORT脂质可以控制mRNA的脾和肺靶向递送；阴离子SORT脂质可实现mRNA的脾脏特异性递送；而可离子化的SORT脂质可用于增强肝脏mRNA的转染效率。SORT技术的普适性不仅在于SORT脂质的选择上，而且适用于不同类型的LNPs中，更重要的是SORT技术对器官选择性mRNA的递送具有可预测性，无需进行大规模体内外实验筛选，这无疑会加快mRNA在今后治疗中的应用。

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图4 SORT技术具有普适性，可以被应用到其他类型的脂质纳米颗粒中，这里选择了MC3 LNPs和C12-200 LNPs为研究对象。

随后，作者分别使用了肝、肺和脾靶向SORT LNPs进行了mRNA递送和基因编辑的应用研究。首先是mRNA介导的器官选择性基因编辑，作者选用了Td-Tomato（tdTom）转基因小鼠，正常状态下，tdTom小鼠只表达本底水平的荧光，当tdtom基因前的终止信号被Cre酶或者CRISPR/Cas9切除后会激活红色荧光的表达，从而方便研究者进行检测。作者分别用肝（20% DODAP SORT）、肺（50% DOTAP SORT）和脾（30% 18PA SORT）靶向LNPs通过单次静脉递送Cre mRNA进行了器官特异性基因编辑，并且通过流式细胞仪技术鉴定了不同细胞类型的编辑效率（图5）。肝实质细胞的编辑效率接近100%，肺部的内皮细胞和上皮细胞的编辑效率分别达到39%和66%，而脾脏的B、T淋巴细胞和巨噬细胞的编辑效率分别为12%、10%和20%。这些研究结果为mRNA介导的器官特异性治疗提供了直接的证据。

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图5 器官特异性SORT LNPs通过递送Cre mRNA在tdTom转基因小鼠成功实现了肝、肺和脾的基因编辑，激活了tdTom的表达。

接着，作者从mRNA移步到了CRISPR/Cas9介导的基因编辑。SORT LNPs包裹Cas9 mRNA和sgRNA复合物，在tdTom小鼠中单次静脉给药后，分别在肝和肺脏观察到了明显的红色荧光信号（图6），虽然脾脏的编辑效率不高，但依旧可以观察到明显增加的红色荧光。随后，作者用相同的策略对内源性基因（PTEN）进行了器官特异性的基因编辑，单次给药后在肝和肺部的基因效率可以分别高达14%和15%！为了进一步研究CRISPR/Cas9基因编辑的应用前景，作者使用肝靶向SORT LNPs，采取3次给药的方法对PCSK9进行了基因编辑。基因水平的编辑效率高达60%，而血液和肝脏中PCSK9蛋白的敲除效率达到了100%！这些结果表明器官选择性SORT LNPs可以介导高水平的基因编辑效率，足以达到疾病治疗的目的。

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图6 SORT LNPs通过共递送Cas9 mRNA和sgRNA在tdTom转基因小鼠和普通C57小鼠中介导了脏器特异性的基因编辑。SORT LNPs在（a，b）tdTom转基因小鼠（tdTom基因）和（c）普通C57小鼠中（PTEN基因）介导的基因编辑；（d-g）肝靶向SORT LNPs介导的肝脏PCSK9基因编辑。

总结而言， 本研究创造性的提出了快速优化和筛选器官特异性LNPs的方法，命名为SORT，SORT适用于各种类型的LNPs，可作为通用的设计指导原则，且无需进行大规模体内外实验筛选。SORT LNPs显示出高效的器官特异性mRNA递送和CRISPR/Cas9基因编辑效果，预计将会极大地促进这些领域的研究。

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