关于组织和细胞培养（动物）介绍

是一种应用最为广泛的体外培养技术。方法很多，总的说来，不外乎原代培养（包括从组织块开始的原代培养和从细胞悬液开始的原代培养）和传代培养两大类。除了细胞的原代培养物以外，通过各种传代培养的方法，还可以得到各种细胞系、细胞株，克隆等细胞的传代培养物。据国际组织培养学会专业术语委员会规定，原代培养物在首次传代后即成为细胞系，而不问其是否能长期连续传代。能连续传代的细胞系可另称为连续性细胞系。在一个细胞系中，由于细胞来自原代培养物中的不同的细胞谱系，并非所有的细胞均具有相同的分化标志和特性。通过克隆形成法或各种选择培养法，有可能从原代培养物或细胞系中把那些具有共同特性或分化标志的细胞群体分离出来，形成细胞株。能连续传代的细胞株可另称为连续性细胞株。克隆又称无性繁殖系，系单个细胞通过有丝分裂所形成的细胞群体，是细胞株的特殊情形。一个克隆中的细胞在遗传性上不一定是均质的，如肿瘤细胞的克隆由于不均质分裂在遗传性上就是不均质的。自从1956年小鼠结缔组织L连续系建立以来，40多年间世界上所建立的各种连续性细胞系、连续性细胞株、克隆的总数估计有5000种以上，其中单是类淋巴母细胞连续系即约有2000余种。中国建立的连续性细胞株系约有 120多种。陈瑞铭等于1960年建立了世界上第一个人肝癌细胞连续系(BEL-16)。

两类培养细胞

体外培养的细胞概括说来可分为两类，一类是以上皮细胞或类上皮细胞为代表的器官专一细胞（即器官实质细胞），一类是以成纤维细胞或成纤维样细胞为代表的间叶细胞。

典型的体外上皮细胞在光学显微镜下为正方形或六角形，细胞紧密相连长成一片，核质比值较高。在电子显微镜下则显出有桥粒、张力原纤维等特殊的形态标志。它可以起源于三个原始胚层中的任何一个，并可区分为正常上皮细胞和肿瘤上皮细胞两种。绝大部分体外上皮细胞只能在原代培养物中存活很短一段时间，不能传代，其原因目前尚无确切的解释，据认为可能与失去了基质细胞的支撑作用有关。少数体外上皮细胞可以因为条件适合传代下去，甚至形成一个连续的细胞株系。迄今为止，形成连续系的细胞几乎都是肿瘤上皮细胞，其成功的机率在人的膀胱癌为1/18。体外的肿瘤上皮细胞绝大多数保持着体内的分化特征，但由于体外环境对它们的选择和改造，某些分化特征（如某些同工酶）可能会有所变异。传代培养的过程中，特别是在所谓不稳定期中的最初几代，某些分化特征（如某些分泌蛋白）甚至可能会丢失。正常上皮细胞几乎不可能形成连续系，迄今所有的所谓“正常的上皮细胞系”实际都是不正常的，有证据表明这些“正常的上皮细胞系”大部分均由干细胞增殖而成。若干小鼠的“正常细胞系”还能在体内形成肿瘤。尽管如此，这些“正常的上皮细胞系”还是很珍贵的，尤其是人的并不多，中国至1984年底，建成的“正常的上皮细胞系”有HL-7702（人肝）、SL7（人肺和小儿包皮）等。

细胞培养技术中所采用的“成纤维细胞”这个词并不精确，是为了方便才沿用。它指的是在体外培养条件下出现的，其形态与真正的成纤维细胞相似的、一切源自间叶组织的细胞。因此，更正确的术语应为“成纤维样细胞”。典型的成纤维样细胞在光学显微镜下呈细长形或梭形，细胞较为疏松地长成一片，或平行成束，或交叉成网，其形态可因培养基及细胞密度的不同而不同。某些类型的成纤维样细胞可以分泌胶原、透明质酸和硫酸软骨素等。成纤维样细胞既可起源于胚胎组织，亦可起源于成体组织。在上皮细胞的原代培养物退化后往往继之有未分化的没有组织专一性的成纤维样细胞生长，此类成纤维样细胞据认为来自小血管的血管形成性间叶细胞。一般说来，成纤维样细胞在体外生存的期限虽比正常上皮长一些，但亦极为有限。在少数情况下，生长渐趋停止的成纤维样细胞，在一定时期之后，可突然又重趋活跃，并不断增殖为可以连续传代的细胞系，其细胞可以在体内形成肿瘤，此种现象称为自发新生性转化，多见于啮齿动物的成纤维样细胞，尤多见于小鼠的成纤维样细胞。著名的3T3细胞系、C3HT10┩细胞系、BHK细胞系皆由此而得。此外，恶性间叶细胞、即起源于间叶组织的肿瘤细胞，要比肿瘤上皮细胞更易在体外增殖传代，目前已有相当多的起源于间叶组织的连续性肿瘤细胞系。

培养细胞的共同特征

无论上皮细胞或成纤维样细胞，无论其来源是正常组织或是肿瘤组织，在体外培养条件下，由于生存环境大体相似，通过适应和修饰，原来在体内差异很大的各种细胞可以变得在形态、代谢、功能、结构（特别是表面结构、细胞内骨架的分布以及气体交换的方式）等方面非常相似，致使彼此难以鉴别。体外培养细胞具备一系列共同的特征。其中特别值得一提的是：任何培养细胞均倾向于去分化；细胞与细胞之间的相互作用有所减弱；生长能力、有丝分裂活动有所激发；细胞的活动能力、吞噬能力及胞饮能力则有所增强。一切侥幸得以传代下去的细胞株系，实际上都是一些经过选择后的细胞群体，均已有所变异。

培养基

培养基的选择和配制是体外培养技术的一个关键问题。培养基由 3部分组成：基础培养基、血清和基质。

自行配制或用现成的化学合成培养基，常用的化学合成培养基有Eagle(包括BME、MEM、DME等)、F10、F12、199、RPMI1640、 EBSS、HBSS等。这些化学合成培养基具有适当的渗透压、能源、氨基酸、维生素、微量元素及缓冲pH值，可以满足许多类型培养细胞的最基本的需要，它虽可维持细胞一段时间的存活，但由于缺乏细胞有丝分裂所必需的各种激素和生长因子，细胞不能在这类相当于平衡盐溶液的体系中进行分裂。

可以提供细胞生长所需的各种激素和生长因子，目前已成为维持细胞有丝分裂不可缺少的物质。常用的血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、人血清和马血清等。培养基中血清的浓度范围为 5～20％，以10％浓度最为常用。但血清有一系列缺点，特别是它的易变性和非限定性，给实验工作带来了难以精确定量和难以重复等困难。因此，尽管它的应用已有相当长久的历史，但决不是理想的培养基成分。

20世纪60年代利伯曼和奥维等首先进行了无血清培养的尝试，经山根、佐藤春太郎等发展，目前无血清培养基（又称无血清限定培养基或简称限定培养基）已在全世界广泛应用和发展，是组织培养技术近年的重大进展。这类培养基主要以各种激素（如胰岛素、各种前列腺素、生长激素等）、生长因子（如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子、神经生长因子、MSA等）、 维生素、载体蛋白如转铁蛋白(铜蓝蛋白等)、微量元素（镉、硒等）、乙醇胺以及贴壁与展开因子（如昆布氨酸、纤维网素等）取代含血清培养基中的血清部分。这样，不但排除了血清的干扰，而且，还可以在更接近体内的条件下维持细胞的功能和活力。山根等发现，不同组织学类型的细胞所需要的活性物质完全不同，而不同动物的同一组织学类型的细胞所需要的活性物质则极为类似，仅在量上有所区别。据此，他们提出“组织定型专一培养基”的概念，以图设计出专一地适用于各种细胞类型的无血清培养基。可以预料，由于无血清培养基的发展，许多有关细胞培养的生物学研究工作将由定性研究进展到定量研究。

也是必不可少的，一般培养用的器皿都是塑料的或玻璃的，足可构成理想的培养细胞的基质以供贴壁之需。血清也能在培养瓶的底面形成一层由附着蛋白分子构成的吸附层，亦有助于细胞贴壁。对于某些细胞还需要在培养基中添加纤维网素、昆布氨酸、白明胶之类的贴壁因子以维持它们体外的生机或增殖力。

体外细胞的保存

鉴于用长期传代的方法来保存细胞株系不但十分困难，而且有可能出现变异，所以培养物应保存在液氮（或-70℃冰箱）中，以10％二甲亚砜或15％甘油作为保存液。目前除了各实验室自己保存细胞外，还设有各种类型的细胞库，随时可以供应实验用的细胞株系。

污染问题

细菌、真菌、病毒或它种细胞均可导致培养物的污染。含抗菌素的培养基固然对细菌和霉菌的污染的控制和预防有一定的作用，但抗菌素本身对细胞也有一定的毒性，抑菌引起的共生现象亦可导致实验的假象。枝原体尤其易与细胞共生，又极难检测，由于部分枝原体需要特殊的氨基酸如精氨酸，枝原体的生长还可以导致培养基中营养成分的专一性丢失。体外培养中的许多难以解释的事件可能就是活跃的或隐伏的枝原体污染所致。其他细胞的交叉污染是一种更为严重的污染，现在，据报告许多细胞系已被HeLa或其他快速生长的细胞系所污染，这些细胞系过度生长并取代原先的培养物。

展望