MTT法测24孔板时 细胞数多 二甲基亚砜（DMSO）溶解甲瓒后溶液颜色深的孔 吸光度反而低

MTT原理
\x09MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide,汉语化学名为 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐,商品名：噻唑蓝是一种黄颜色的染料
\x09MTT比色法,是一种检测细胞存活和生长的方法其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中,而死细胞无此功能二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量在一定细胞数范围内,MTT结晶形成的量与细胞数成正比该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等它的特点是灵敏度高、经济 缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害
MTT 溶液的配制方法 通常,此法中的MTT 浓度为5mg/ml因此,可以称取MTT 05克,溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中,用022μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌,放4℃ 避光保存即可在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好 需要注意的是,MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力,但不能测定细胞绝对数在用酶标仪检测结果的时候,为了保证实验结果的线性,MTT 吸光度最好在0-07 范围内
\x09MTT一般最好现用现配,过滤后4ºC避光保存两周内有效,或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存,避免反复冻融,最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解我一般都把MTT粉分装在EP管里,用的时候现配,直接往培养板中加,没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了
\x09MTT有致癌性,用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套配成的MTT需要无菌,MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系,毕竟时间较短,或者你不放心的时候可以把 *** 作台上的照明灯关掉
\x09配制MTT时用PBS（ph=74）溶解PBS配方：Nacl 8g ＋ Kcl 02g ＋ Na2HPO4 144g ＋ KH2PO4 024g调pH 74,定容1L
普通MTT法实验步骤：1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细
\x09胞接种到96孔板,每孔体积200ul2: 培养细胞：同一般培养条件,培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）3：呈色：培养3-5天后,每孔加MTT（噻唑蓝）溶液（5mg/ml用PBS配制,pH=74)20ul继续孵育4 h,
\x09终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液
\x09每孔加150ul DMSO,振荡10min,使结晶物充分融解4：比色：选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为
\x09横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线
药物MTT法实验步骤贴壁细胞：1: 收集对数期细胞,调整细胞悬液浓度,每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度 1000-
\x0910000 孔,（边缘孔用无菌PBS填充）2: 5%CO2,37℃孵育,至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上,
\x09细胞贴壁后即可加药,或两小时,或半天时间,但我们常在前一天下午铺板,次日上午
\x09加药一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔建议设5个,否则难以反应真实情况3: 5%CO2,37℃孵育16-48小时,倒置显微镜下观察4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml,即05%MTT）,继续培养4h若药物与MTT能够反应,
\x09可先离心后弃去培养液,小心用PBS冲2-3遍后,再加入含MTT的培养液5: 终止培养,小心吸去孔内培养液6: 每孔加入150ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解在酶联免
\x09疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值7: 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜）,对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介
\x09质、培养液、MTT、二甲基亚砜）
悬浮细胞：1: 收集对数期细胞,调节细胞悬液浓度1×106/ml,按次序将①补足的1640（无血清）培
养基40ul ；②加Actinomycin D（放线菌素D有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100g/ml,需预试寻找最佳稀释度,1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔）,共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）每板设对照（加100l 1640）
2: 置37℃,5%CO2孵育16-48小时,倒置显微镜下观察3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml,即05%MTT）,继续培养4 h（悬浮细胞推荐使用
WST-1,培养4 h后可跳过步骤4）,直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）
\x094、离心（1000转x10min）,小心吸掉上清,每孔加入100 ul二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值
\x095、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜DMSO）,对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）,每组设定3复孔
注意事项：(1) 选择适当得细胞接种浓度(2) 避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验在呈色后尽量吸尽孔
\x09内残余培养液(3) 设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照其他试验步骤保持一致,
\x09最后比色以空白调零
(4) MTT实验吸光度最后要在0-07之间,超出这个范围就不是直线关系
\x09(5) 用96孔板培养细胞做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适
\x09根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液,便于
\x09DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定
\x09(6) 一般每孔4000个细胞为宜,既细胞浓度在20000个/ml,MTT加20ul,作用四小时后洗掉上清液,注意不要将甲瓉洗掉,然后每孔加150ul DMSO,在脱色摇床上振荡10分钟,然后测吸光值

做MTT实验 细胞铺板总是不均匀 有何良方解决
主要是基于SDH的活性，某些细菌有近似的代谢特性可能会干扰结果，
MTT实验:
将细胞以1×105/ml浓度接种于96孔培养板，100μl/孔，设8孔重复，孵育过夜；细胞贴壁后，用无血清培养液孵育24h，使细胞同步；弃上清液，以培养液配制不同浓度的药物100μl/孔，孵育24h，加入MTT液50μl/孔，继续孵育4h，倒置相差显微镜下观察，可见蓝紫色针状结晶；吸去上清，加入DMSO100μl/孔，室温振荡15min，待结晶完全溶解，酶标仪550nm波长检测吸光度值。
注 MTT可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。

考试内容上是没有区别的，主要是时间上的差异，一个在联考之前，一个在联考之后。但是正因为时间上的差异，又会影响你的整个备考节奏，如果你不选择提前批面试，那么后续的备考你需要同时准备联考和面试，这样在精力和时间分配上会需要花更多心思。但如果你选择了提前批面试，而且又很幸运的拿到预录取，那么恭喜你，后面的联考备考将会轻松很多，只需要花时间补上自己的知识点漏洞即可，压力也会小很多。但如果没有通过的话，其实也是一次很好地总结经验的机会，虽然后面得花点时间，但是不至于过于紧凑，所以我还是建议大家重视提前批面试，目前上海交大中银科技金融学院技术转移硕士的提前批面试只剩最后一批了，需要抓紧时间准备了。望百度采纳

你使用什么波长，跟你测什么东西没有关系，只跟你最后一步显色所使用的底物有关系。波长是同底物显色的颜色相对应的。
到这个网站看下吧>应该明确实验前

1。选择适当浓度的细胞接种。的内贴壁细胞的96孔培养板中，在正常情况下，包括约105个细胞。但由于该地区有很大的不同，在不同的细胞附着在MTT法，预实验检测其贴壁率，倍增时间以及种子细胞的生长曲线的条件下，确定测试孔接种细胞数和温育时间，为了确保列车终止诱导的细胞过满。因此，在为了保证MTT晶体形成的细胞数成比例呈线性关系。否则，细胞的数目的敏感性降低太多，太少没有观察到差异。
2。集合中的药物浓度。请务必看到更多的文献，参考其他人的结果，然后给出一个比较大的范围内的第一次筛选。根据自己的筛选狭窄的浓度和时间范围再细筛的结果。记住！否则，可能会使用的时间和浓度的药物的有效浓度和时间。

3。设置的时间点。 OD值吗？在不同的时间点，输入Excel工作表中，并最终在不同时间点的抑制率变化的测量，绘制图形的变化，当曲线变得平坦（高原）的时间点，应使用最好时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制最明显的表现）。

4。孵化时间。 200UL 10 4-5电源增殖细胞的培养液中是难以维持68H，营养不足，细胞增殖阶段逐渐趋向G0期往往仍影响的结果，我们在48小时介质中被改变了。

5MTT法只能测定相对细胞数和相对活力，不能绝对数量测定细胞。做MTT，尽量无菌 *** 作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值增加。

6。理论未必全是。要根据自己的实际情况进行调整。

实验对照孔加药孔孔应设置为零。零孔加培养基，MTT，二甲亚砜。控制井和计量孔必须加细胞培养基中，MTT法，二甲亚砜，和不同的是添加到媒体控制井，而溶解该药物中加入不同浓度的药物的给药组。

8。避免血清干涉。含15％FBS培养基中培养的细胞中时，高血清物质会影响试验井的光吸收值。将测试的灵敏度测试增加背景。因此，它通常是优选的是小于10％胎牛血清的培养液中。着色后，尽量吸净培养孔残余的培养基。

实验步骤

贴壁细胞：

1。上收集的细胞数，调整浓度的细胞悬浮液加入到每个孔100ul铺板所测试的细胞调节至密度为1000-10000孔（边缘？孔填充用无菌PBS中）。

25％CO2，37℃孵育，直到细胞单层覆盖的底部的孔（96 - 孔平底板），添加药物的浓度梯度，在原则上，细胞的粘附给药或两小时或半天的时间，但我们常在前一天下午铺板第二天早上剂量。一般为5-7梯度，每孔品100μl，位于3-5井。建议设5，否则难以体现

35％的CO2，并在37°C孵育16-48小时，倒置显微镜下观察到的真实情况。

4。添加到每个的阱20ulMTT溶液（5mg/mL的，或05％的MTT），并培养4小时。用MTT反应的药物可以先离心丢弃培养基，用PBS仔细洗涤2-3次，然后添加到培养基中含有的MTT。

5。终止的文化，并认真吸收孔培养基。

6每孔加入150ul二甲亚砜，设置振动筛在低速振荡10分钟的晶体完全溶解。在OD490nm的酶联免疫吸附检测器测量的每个孔的吸光值。

7。同时置零孔（培养基，MTT，二甲亚砜），对照孔（细胞，相同浓度的药物溶出介质，培养基，MTT法，二甲亚砜）

悬浮细胞：

1）收集对数生长期细胞，调节细胞悬液浓度为1×106互补序列①1640（无血清）介质40ul;②加放线菌素D（有毒）10UL稀释培养基升的？克/毫升，需要预先测试，以找到最佳稀释,1:10-1：20）;③需要检测对象10UL;④细胞悬浮液50μl（即，5×104cell /孔）的100ul加入96 - 孔板（边缘？孔填充用无菌水）。建立控制每块板（加100（原液100 1640）。
2）在37℃，5％CO2孵育16-48小时，并在倒置显微镜下观察。

3）每孔加入10微升MTT溶液（5毫克/毫升，或05％的MTT），并培养4 h。 （悬浮细胞推荐WST-1，培养4小时后可以直接跳到步骤4），直接酶联免疫吸附测定的OD570nm 630nm的校准测量每孔的吸光度值）

4）离心（ 1000转x10min）仔细吸掉上清液，每孔加入100微升二甲亚砜中，设置摇动器在低速振荡10分钟，完全溶解的结晶。在酶联免疫吸附测定OD570nm（630nm的校准）测量的吸光度值？为每个孔。

5）设置零孔（培养基，MTT，二甲基亚砜）对照孔（细胞，相同浓度的药物溶出介质中，在培养基中，MTT法，二甲亚砜），每个设置的3个井。

MTT准备

MTT通常情况下，最好使用4℃避光过滤器后两周内，或配制成20,10,5保存在 - 20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量包装，用黑袋或黑纸，铝箔及包装暗，避免分解。我一般都把MTT粉包装EP管，现有的服务直接添加到培养板，不需要一下子有这么多的，特别是当它绝对MTT变为灰绿色不能重复使用。

MTT致癌性，使用时要小心的那种透明薄膜手套的最佳条件。被称为MTT需要无菌，MTT细菌，是非常敏感的;到96孔板一个PBS 黑暗中额外的时间并不重要，毕竟，时间是短暂的，你不用担心时，你可以把关了灯手术台。

制备MTT;溶解，还配备用盐水在60℃水浴中进行增溶。

PBS配方：

氯化钠8克

KCL02克

磷酸氢二钠144克

> KH2PO4024克

调pH值74

给定容量1L

细胞接种（平台）

细胞30代不要使用，因为状态并不好，培养板中使用一个很好的（最好是进口板），坏板或重复使用的板仅做预实验。

最佳接种密度计算出来的按照预实验接种后，细胞生长抑制率（或增值率），因为关于OD值吗？细胞密度10000/ml的测量时间间隔呈直线关系最好的，最可靠的结果。如果店铺是太稀细胞的杀伤不会很明显，可能都过于密集的细胞凋亡，细胞生长速度过快的营养是不够的，最后导致死亡。过密或过少的细胞，细胞增殖将是过快或过慢，差线性关系，其增值率。因此，MTT细胞的密度使用更10000/ml的，100ul /孔。

细胞密度的特点，不同的细胞，如果细胞刺激作用的药物，那么细胞浓度为小点，如果你这样做对细胞有抑制作用的药物，然后取更大一点细胞浓度，因此，与对照的差异，该数据是更好。悬浮细胞的各孔中的细胞数达到105，贴壁细胞103-104。

其他的声音：

第一个单元格播种密度不能太一般每孔1000就足够了，我想，宁少勿多。特别是对肿瘤细胞。 10000 /孔是太高，所以，即使药物，MTT法不能表达的最佳点板浓度在4000-5000 /孔，太少的SD值。

2MTT本身是一个相当厚的实验约10％，增殖率的波动也就不足为奇了。特别是新手，有20％的波动也是常见的，因此它可能是由于技术原因，特别是种板技术必须过关的。

我MTT法检测肿瘤细胞，这些细胞长一开始我100000/ML浓度的疫苗接种，结果细胞长的太满，结果梯度也没有线性关系。调整后的浓度使用了4000080000/ML浓度MTT法，做的好点的是6000070000/ML组的浓度。 40000 / M的基团的浓度，是因为这些细胞是以下，药物作用或只是没有一个有良好的线性关系的梯度，根据细胞生长速度，以及药物的特性（的时间依赖关系，并的浓度依赖性的药物），以确定培养的时间是48小时或72小时。

一定要注意避免细胞的细胞悬液混合沉淀下来，在每个孔中的细胞数的范围，收到了一些必要再混合均匀。移液管 *** 作要熟练，避免人为错误。虽然更准确比移液管移液管，但如果 *** 作不熟悉，CV将在8％左右。此外，吹了太多的时间，也影响细胞活力。因此，熟练的鞋，尽快在黑板上。

让我谈谈我的一点经验：

1。狗新花样不能太多悬挂的总的3-4倍，吸液管液量可能会比较容易混合。 10毫升优选地安装的悬浮液中34毫升：该悬浮液的离心管太少容易吹气泡，悬浮液的特定也是不容易被风吹到单细胞悬浮液。 。 。

移液管移液管最好在1毫升左右：吸入过量的液体，看起来液管余下的数，如吹打容易起泡吸管吸了很多量过小，强度移液是不够的，将移液不均匀。如果吸液量1毫升稻草，总液量，在约5ml的好处

吸气时，悬挂在底部，然后抬起，但吹了下来，不留液体的表面，否则容易一拳砸的气泡。

4。狗新花样，你可以数100吹打均匀（前约30-50倍的吹打加细胞基本上差不多均匀。加细胞分别接种2孔反复移液管移液3次3次后，他们把他们的q挂在5秒内的细胞悬液，然后划出一定的速度悬浮液）。

用吸头，每孔加入到细胞中不要太猛了，否则你会发现细胞在想要添加的移液管尖中的孔的底部的势头由于收集了一堆，一般在这种不均匀的分散液接触抑制周围的孔的底部的中心，影响细胞的生长。因此，速度不能太快，也不能太慢。我习惯了增加每块板水平握手后，左一个右其次，移动的答复中，细胞可以均匀地分散这些。 （铺板技术是MTT法的关键，也是基础，我们必须练好，一旦学生振荡器和混合与旋涡细胞，最后一个单元格都死了，使用这种方法是不建议混合细胞
BR />加入MTT

个人认为MTT最关键的是你的手机号码和MTT适当的比例补充说，真正起作用的，和具体的细胞数量之间的关系和真正的工作真的不好确定，我认为MTT支付超过最低量好一些

MTT各种报告的MTT，一般是过度10UL不够的，如果你不使用96孔板， MTT按照10％的比例超过100ul培养基地。，加入MTT振荡让MTT和媒介组合，但这个应该不大。

有个别的孔，如立即加入MTT变蓝黑色，污染的可能性是很大的，另一个在前面的MTT摊薄细胞仍然需要适当的方法来过滤消毒。可以加MTT前显微镜下才能看到，如果有一个孔染菌，染菌孔附近往往是 />
血清白蛋白对大多数的药物的组合的效果，它是可能的分开的药物和MTT一起看到的将反应MTT法不能反应，不必除去水培的含有药物的溶液，直接加。

上层清液

争：

1加DMSO液体吸掉，但培养液，紫色晶体吸收之前，该第一的平板离心机，2000转，5分钟，然后吸掉上清液（如果是悬浮细胞，此方法建议在2500rpm 10分钟离心分离的悬浮细胞，并做MTT的最好的圆底96孔板中的96 - 孔板，注意不要结晶颗粒吸掉上层清液后，建议每孔吸出150-160ul）

2。每次我都会MTT和孵育4小时，然后离心1000G 5分钟q小心吸去上清液，或将一小部分蓝水晶吸出，所以还是建议翻转颠倒了！

另外，我们可以直接在板翻转颠倒（垫层滤纸）2-3倍的方式“吸”是不容易使细胞脱离出来。轻拍，或倾斜一点帮助吸液管，紫色晶体几乎没有可见的列，但你自己的细胞贴壁的前提下，比较监狱，半贴壁生长的细胞容易脱落。药物作用时间长，阴性对照组的细胞可能是由于过多离开MTT加入后形成的结晶漂起来，所以不能直接排放

MTT，这一步必须小心，不要使用贴在墙上倒立的方式，因为是不强大的单元格将被倒掉，从而影响OD值吗？悬浮细胞，不拍打上清液。 ，离心后，不拍打这种方法杀了人。

5。加入MTT反应完成后3-4h后，在96孔板的作用是从孵化器中删除要轻柔，避免振荡结晶，它溜了。您可以尝试在96孔板倾斜30度角，然后的q口慢慢吸一些细胞排球吸，有些人会用移液器吸头吸病人，q口下的强度和方向，以确保每个孔是不要让吸头接触到孔底，一次后倾斜孔板，不反复倾斜的平直，这样也会使晶体脱落。

6。移液与医用注射器登上教训针对角线的经验教训沿着培养基MTT的墙壁，好像我1毫升针小心地吸可靠的比其他的方法，一般不吸紫色晶体。

避免上层清液和改进的方法

一般容易发现，即使贴壁细胞在96孔板离心式离心机，的MTT溶解在DMSO，结果是没有好，不能得到预期的结果重复性差。

解决方法1：以下文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT法，中国期刊的药品，1993,24（10）:455-457 BR />
具体方法如下：

三溶解液：10％SDS，溶于蒸馏水中，5％异0012mol/LHCL的。

三联溶解解决方案：SDS10g，异丁醇5毫升的10M盐酸01毫升双蒸水溶解配成100mL溶液

*** 作：细胞悬浮在培养板中，加一定密度的解决方案，90ul /孔;管理，然后（悬浮细胞）在同一时间或4h后（贴壁细胞）通过加入不同浓度的药物10UL /空穴，位于三井。另外，每块板另一个没有零孔（仅添加到培养基中，无细胞和药物）培养2d后加入MTT溶液20ul /孔，和文化继续4小时，然后加入上述的三重液体品100μl/孔，在37℃静置过夜，用酶测定的标准仪器孔A570值？

优点：简化 *** 作，提高了可靠性。

解决方法2：日本同事有一个新的试剂CCK-8试剂，CCK -8试剂可用于简单和准确的细胞的增殖和毒性分析其基本原理是：含有的试剂WST-8 [化学名称：2 - （2 - 甲氧基 - 4 - 硝基苯基） - 3 - （4 - 硝基苯基）-5 - （2,4 - 二磺酸苯基）-2H-四唑单钠盐]，这在电子载体1 - 甲氧基-5 - 甲基硫酸盐吩嗪二甲基（1 - 甲氧基PMS）线粒体脱氢酶的作用降低的高度水溶性的染料（甲臜染料）A的产生与活细胞的数目的数目成正比，所以此功能可以用于直接的细胞增殖和毒性分析CCK-8试剂已预先装入的细胞增殖和毒性分析所需的组件，未经稀释，然后缓冲区或中等，没有任何放射性同位素和有机溶剂的CCK-8试剂。因此，没有特别的技能，你可以让每一个用户准确，可重复的实验结果。

★优势 / a>
1，简单的一个步骤的结果

2，节省时间，不需要预制开放

3，安全没有必要放射性同位素，有机溶剂
>
4，迅速消除溶解除沉 *** 作

5，高灵敏度，灵敏度比MTT

6，重复性几个不错的步骤，无损，准确

是比较昂贵的，如果充分的资金，这是件好事。

★细胞增殖实验使用：

1，接种细胞悬液100μL96孔板，预先放置在37℃，在5％CO 2培养箱培养。

2在每个孔中引入CCK-8试剂10μl的。

培养板在孵化器1-4个小时。

4，测定吸光度在450nm波长为600nm或600nm的波长参考。

解决方法3：使用MTS / a>
解决方案4：

加入DMSO

放弃孔内液体，最好不要更换相同数量的实验DMSO加入DMSO清洁，直接加入到DMSO首先，除去上清液，沉淀将难溶于培养基颜色检测测量时，将影响最终的结果，但前提是不能使细胞与吸掉，因为错误是远大于培养基中没有放弃一个干净的错误，所以，以确保细胞的前提下，尽可能不虹吸的培养液虹吸如果培养溶液不是一次性清洁空白孔应留下的培养液相同量的，所以检测时的培养液的影响，可以除去尽可能多的DMSO的量为100ul或150ul

1。添加的DMSO后使用振荡器轻轻振摇5 - 10分钟时间控制密切越好，放置时间长了会影响结果，该值将过大，其结果是不可靠的。
2。后加入DMSO排球反复抽吸溶，尽快解散后检测。实验孔是小的，它建议，这种方法，因为其更好的效果比振荡溶解。

3，或者在37度把培养箱中培养15分钟，溶解结晶

振荡，让甲溶解，以便更好地测量的吸光度振荡96孔板具体地说，振荡器，目的：凿孔泡沫。气泡的存在下，由于其光的反射和折射效果（原则读者是通过特定波长的测量样品中的特定物质样品的吸光度推测）的浓度，会导致结果抵消了测定OD值吗？
至于测定给出的波长是不同的颜色溶液，DMSO，溶解紫（红）色，490nm处的最大吸收值，而在ATCC的MTT试剂盒使用的是不DMSO，它的测定波长为570（在ELISA实验，OPD为底物测得的波长为492，选择的TMB底物溶液是450）; SDS和酸化异丙醇选择570nm的，并建议作为参照波长等于655nm。

DMSO溶解经过10分钟内测，越放颜色越深，SDS溶解液测定吸光值，其值在三天内保持不变。

细胞密度太大测定吸光度细胞密度过大，吸光率也小;另一个细胞状态的关系，细胞状态不好的吸光度值低;少量的细胞，或短的时间内培养的OD值会比较低。每个洞之间的差异尤为明显说明可能存在的污染，空白孔的OD值过高，很可能是细菌的污染。

井直接OD值差别一般应在01-015不同的考虑：1。种子细胞不统一或疫苗接种时，应保证每一个孔一般为1000-10000元以及细胞细胞计数，加入细胞悬液培养基中定容，轻轻吹打几次，使细胞均匀分布的，因此，这是更好的不是直接加入预定体积的细胞悬浮液，接种疫苗应加入含有血清的介质2。粘附时间:18-24小时，如果没有，而不是悬浮细胞可虹吸
/>一般，为了实验的精度，和各浓度可提供5-6井可以最终的统计，可以除去的最大值和最小值，或荒谬的值？其特征在于，所述数据被除去，这些离谱数字细胞污染，是否在培养过程中细胞的死亡，文化，蒸发过度的附加组件的MTT溶液是不准确的，在5％二氧化碳培养箱中培养，在37°C，无论是时间常数（1-4小时）有密切的关系，当然的OD值的测定仪器状态是正常的，是非常重要的！（一般热身20分钟）。

MTT吸光度误差在02至08之间。分析化学相关的兰伯特Beer定律，朗伯 - 比尔定律骨密度分析偏差，通常在标准曲线的情况下是不是线性的，尤其是吸光物质的浓度较高时，可以清楚地看出通过原点到浓度轴弯曲的现象（吸光度轴弯曲）情况称为朗伯 - 比尔定律的偏离定量的曲线的弯曲部，将产生较大的误差。骨密度分析仪测量不准确的误差的主要来源。光度计具有一定程度的测量误差。这些错误可以是来自于光源不稳定，变化的实验条件下偶然不准确的读数。

光度计透射的标尺刻度是均匀的。吸光度标尺刻度不均匀。波动对传动比一定值时，读出的相同的工具;吸光度读数波动不再是一个固定的值。吸收更大的错误读数波动而引起的透光率或大或小，浓度测量误差大，更大的吸光度，最好的光度当选的吸光度读数不下降在中间规模的要被测量的透射率T在15％至65％的范围内的溶液，或在两端时的吸光度，A是在0208之间，为了确保较小的相对误差的甲= 0434（或透射比T = 368％），最小相对误差的测量。

其他的声音：

最好的570nm波长过滤器，MTT吸光度测量。在此波长的峰值，在其他词语具有大致490nm处与其他波长的高灵敏度，但我的经验的灵敏度降低了一半。
2 BIO-TEK，我们使用ELx800，一般值2是可靠的，如果该值是要考虑它是否是一个错误在实验过程中，我已经看到了花园的一些职位OD值可能与活细胞数在02-12范围内具有良好的线性关系，复孔太大的区别，但OD值在03-09范围内的好，如果你的OD值？此范围之外的，做实验，细胞计数可能不适合，你应该调整细胞的数量。边缘效应
/>

孔一般只有空白，非培养细胞，或这四条线中的数据将是高或低的由圆圈包围的96孔板，96孔板的培养箱中因为缺乏湿度，和孵化器具有一定的温度，由于温度梯度，使得边缘的孔蒸发更快，导致的各个组成部分中的培养基中的浓度增加，导致这种现象的不同的细胞状态，它是必要的，以保证湿度的培养箱中，并以降低的频率和持续时间的开关培养箱。方法：所有周围的圆形孔的孔板，“否”，的影响是非常大的，最外面的圆必须添加水，PBS或培养液中，只要你能防止水分蒸发。

如何计算的IC50后的寇方法：

（1）lgIC50 = XM-I（P- （3-PM-PN）/ 4）

XM：LG的最大剂量

I：LG（最大剂量/相邻剂量）

P ：正反应速率和

PM：最大的阳性率

PN：最小阳性率

例如：各组浓度01,001， 0001,00001,000001,0000001，稀释10倍，与最大浓度为01的抑制率分别为095，080，065,043,021,006到

计算公式：
PM =在
Pn的095
= 006

P = 095 +080 +065 +043 +021 +006 = 31

XM = lg01 = -1

LGI = lg01/001 = 1

lgIC50 = -1-1 （31-（3-095- 006）/ 4）= -36025

IC50 = 000025

（2）Bliss法：自己的检查书

（3）IC50计算软件，请参阅下文附件

（4），使用EXCEL趋势线寻求IC50约LD50的方法与此类似！

（5）网上寻求IC50或EC50： HREF =“>

跟MTT法区别如下：

一、指代不同

1、MTT法：利用有色物质对特定波长光的吸收特性来进行定性分析的一种方法。

2、MTS法：是一种检测细胞存活和生长的方法。

二、原理不同

1、MTT法：为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

2、MTS法：以生成有色化合物的显色反应为基础，比色分析对显色反应的基本要求是：反应应具有较高的灵敏度和选择性，反应生成的有色化合物的组成恒定且较稳定，它和显色剂的颜色差别较大。选择适当的显色反应和控制好适宜的反应条件，是比色分析的关键。

三、用途不同

1、MTT法：方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。

2、MTS法：采用具有分光系统(单色器)及检测器的分光光度计，使测定结果准确、省时，选择性好。

参考资料来源：百度百科-比色法

参考资料来源：百度百科-MTT法

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