B 站地址:https://www.bilibili.com/video/BV1vN411o7r3?p=5
【中科院】分子生物学-朱玉贤第四版笔记-目录- 4. 转录 (transcription)
- 4.1. 中心法则 central dogma
- 4.2. RNA 合成的特点
- 4.3. 转录与复制的区别
- 4.4. RNA 分类
- 4.5. RNA 的功能
- 4.6. 转录相关的关键术语
- 4.7. 原核生物的转录
- 4.7.1 原核生物 (E.coli) 的 RNA 聚合酶全酶 α~2~ββ'σω
- 4.7.2 原核生物的启动子结构 ★★★
- 4.8. 真核生物 mRNA 的转录
- 4.8.1 真核生物启动子的结构特点
- 4.8.2 真核生物的 RNA 聚合酶
- 4.8.3 真核 RNA 聚合酶Ⅱ的转录(启动子的识别、起始、延伸过程)
- 4.9 真核生物 RNA 转录与加工
- 4.9.1 mRNA 的转录后加工与编辑★★★
- 4.9.2 rRNA 的加工
- 4.9.3 tRNA 的加工
- DNA 是遗传信息的载体,它通过转录生成信使 RNA(mRNA),翻译生成蛋白质的过程来控制生命现象。
- 蛋白质是基因表达的产物,基因表达主要包括转录和翻译两个基本过程,其中转录是基因表达的核心步骤。
- 转录:以 DNA 链为模板拷贝出一条与 DNA 链序列完全相同(除了 T→U 之外)的 RNA 单链的过程。
- RNA 的合成是以反义链(模板链)为模板,以 5’→3’方向合成的,合成的 RNA 的序列是与 DNA 编码链(意义链)相同。
- 同在 DNA 中一样,形成磷酸二脂键 (
Phosphodiester bonds
)。 - 必需的成份:RNA polymerase , rNTPs, transcription factors, promoter & terminator/template
(1)RNA polymerase
:
细菌 Bacteria:全酶 (Holoenzyme) α2ββ’σω。一种核心酶和多种因子。
真核生物 Eukaryotes:三种 RNA 聚合酶polymerase Ⅰ nucleolus 28S, 18S, 5.8S rRNA polymerase Ⅱ nucleus mRNA, snRNA polymerase Ⅲ nucleus tRNA, 5S, snRNA
- 转录是以两条 DNA 链中的一条 DNA 链为模板合成 1 条 RNA 分子;而复制是以反向平行的两条 DNA 链为模板合成 2 条 DNA 分子。
- 在转录中 DNA 的 解链 是有限的、短暂的,只发生足够长度的链分离以便 RNA 聚合酶“阅读”DNA 模板;而在复制过程中两条 DNA 母链永久性地分开。
- 转录在化学和酶反应上类似于复制,但是不同于复制:
① 转录产物是 RNA (核糖核酸),复制产物是 DNA(脱氧核酸);
② RNA 聚合酶催化反应不需要引物 (de novo 合成,从头合成 );
③ 错误率较高 (error rate: 10-4),因为没有 3’-5’外切酶活性;
④ RNA 产物不与模板链配对。 - 不同于 DNA 双螺旋结构,RNA 主要以单链形式存在于生物体内。
① RNA 分子能够形成分子内的碱基配对,形成局部的双螺旋和假结 (Pseudoknot)
结构。
② RNA 的二级结构:
G:U 配对;
折叠成局部双链结构:hairpin, bulge, loop
;
RNA 的双螺旋结构类似于 DNA 的 A 构型(小沟宽而浅,大沟窄而深,相互作用蛋白的氨基酸不容易进入大沟)。
- 蛋白质合成
a. mRNA: 作为基因和蛋白质合成机器之间的中间体。
b.tRNA: 作为 mRNA 中密码子和氨基酸之问的接头。
c. rRNA: 发挥结构作用,如核糖体的重要组分。 - 作为遗传物质:某些病毒自我复制中的模板
- 作为调节分子
a. Small non-coding RNA 通过序列互补地结合并干扰某些 mRNA 的翻译。
b. snRNAs: 参与真核生物中 mRNA 前体分子的加工 - As catalysts (ribozyme) 作为催化剂(核酶)
一些 RNA(包括核糖体的结构 RNA)是催化细胞中重要反应的酶。
-
编码链(有意义链)、模板链(反义链)
编码链(
coding strand
): 与 mRNA 序列相同的那条 DNA 链,或称有意义链 (sense strand) 。
模板链(template strand
): 根据碱基互补原则指导 mRNA 合成的 DNA 链,或称反义链(antisense strand)。 -
转录单元 (
transcription unit
):是转录成单个 RNA的 DNA 序列,起始于启动子并终止于终止子。
转录起始位点 (Transcription start site
) 是指与新生 RNA 链第一个核苷酸相对应 DNA 链上的碱基,通常为嘌呤 A 或 G。通常在起始核苷酸的两侧为 C 和 T (i.e. CGT or CAT) -
启动子:是一段位于结构基因 5’端上游区的保守的 DNA 序列,能活化 RNA 聚合酶,使之与模板 DNA 准确地相结合并具有转录起始的特异性。
-
增强子
-
RNA 聚合酶
RNA polymerase
是转录过程中最关键的酶。
① 主要以双链 DNA 为模板,以 4 种核苷三磷酸 (rNTPs
)作为活性前体。
② 需要 Mg2+/Mn2+为辅助因子。
③ 不需要任何引物(但是可以人为加一段已知序列的引物(带标记的)来转录,便于纯化)。
④ 以 5’→3’方向合成 RNA 链。
⑤ 缺乏 3’→5’外切酶活性。
⑥ 是一个含有多个亚单位 (multi-subunit) 的酶。
RNA 聚合酶需执行的功能:
(1) 识别 DNA 双链上的启动子;
(2) 使 DNA 变性在启动子处解旋成单链;
(3) 通过阅读启动子序列,RNA pol 确定它自己的转录方向和模板链。
(4) 最后当它达到终止子时,通过识别终止子停止转录。
- 大肠杆菌只有一个核心酶
Core enzyme
α2ββ’ω ,参与转录延伸。 - σ 只与转录起始有关,通过使 RNA 聚合酶全酶与启动子紧密结合而启动转录。
- 所有原核生物基因都由相同的核心酶转录,基因特异性取决于 σ 因子,不同的 σ 因子结合的启动子位置不同。
- RNA 聚合酶的 β 和 β’ 亚基具有 DNA 模板的通道。
-
在原核生物中,
-10 区
和-35 区
的距离约 16~19 bp, 过大或过小都会降低转录活性。这可能是与 RNA Pol 本身的大小和空间结构有关。 -
-10 区 (-10 box, Pribnow 区/框盒)
是由 5 个核苷酸组成的保守序列,是聚合酶结合位点,其中央大约位于起点上游 10bp 处,所以又称为 -10 区。 -
-10 box 特点:
① AT 较丰富,易于解链;
② 其保守序列为TAtAaT
,位于-10bp 左右,保守序列小写字母表示该碱基保守性略低;
③ 突变后会改变启动子效率;
④ 与 RNA pol 紧密结合形成开放启动复合体;
⑤ 使 RNA pol 定向转录。 -
-35 区的发现: 研究发现,只有
-10 区
是不能结合 RNA 聚合酶的。从噬菌体的左、右启动子 PL 及 PR 和** SV40 启动子**的 - 35 bp 附近找到了另一段共同序列:TTGACA。 -
35 box ( Sextama 盒 )
其保守序列为 TTGACa, 与 -10 序列相隔 16-19bp。
为 RNA pol 的识别位点。
是 RNA 聚合酶与启动子的结合位点,能与 σ 因子相互识别而具有很高的亲和力。但不能被 RNA Pol 的核心酶识别,核心酶只能起到和模板结合和催化的功能。 -
原核生物启动子的共同特点
(1) 位置和距离都比较恒定,都在其控制基因的 5’端,常和 *** 纵子相邻;
(2) -35 序列,-10 序列等特征序列都十分保守;
(3) 都含有识别 (R ) 、结合 (B) 和起始 (I) 三个位点;
(4) 直接和多聚酶相结合,与 σ 结合决定转录的特异性。 -
E. coli σ70 基因的一级结构
-
被含有σ70 的 RNA 聚合酶全酶识别的典型的大肠杆菌启动子
σ因子自身并不能与 DNA 结合,但与核心酶相互作用后暴露出σ因子的 DNA 结合域:β’ 亚基的氨基酸片段促进 σ因子与启动子 -10 框的非模板链的结合。 -
σ因子可以选择哪些基因将被转录:
σ70 (RpoD)-“管家”σ因子/主要σ因子,转录生长细胞中的大多数基因。制造保持细胞存活所必需的蛋白质。
σ54 (RpoN) -氮源缺陷应激σ因子
σ38 (RpoS) -饥饿应激σ因子
σ32 (RpoH) 热休克应激σ因子
σ28 (RpoF) -鞭毛σ因子
σ24 (RpoE) -极端/极端应激σ因子
σ19 (FecI) -柠檬酸铁σ因子,调节用于铁运输的 fec 基因的转录 -
转录的示意图
转录泡 (Transcription bubble
) 的长度为 12-14bp, 其中 RNA-DNA 杂交链 (DNA/RNA helix) 的长度为 8-9bp。 -
转录的基本过程
- (1)
Initiation
起始- ①RNA 聚合酶结合启动子。RNA 聚合酶与启动子 DNA 双链相互作用并与之相结合。
- ②First few
phosphodiester bonds
form. 转录起始前,启动子附近的 DNA 双链分开形成转录泡以促使底物核糖核苷酸与模板 DNA 的碱基配对,解链长度约为 10-17bp。开始形成** 3 个磷酸二酯键** (3 个磷酸处是 转录起点,不会与别的核苷酸成键,第一个转录的核苷酸通常是 ATP & GTP)。
- (2)
Elongation
延伸:RNA 聚合酶离开启动子,沿 DNA 链移动并使新生 RNA 链不断伸长的过程就是转录的延伸。
β和β’ 亚基形成夹子将 RNAP(RNA 聚合酶) 附着在 DNA 上。RNA 聚合酶本身沿着反义链以 3’→5’ 方向移动,共价地向生长 RNA 链的 3’端添加核糖核苷酸;随着 RNA 聚合酶的移动,DNA 双螺旋持续解开,暴露出新的单链 DNA 模板,新生 RNA 链的 3’末端不断延伸,在解链区形成 8-9nt RNA-DNA 杂合物。
大肠杆菌 RNA 聚合酶的活性一般为每秒 30-90 个核苷酸。 - (3)
Termination
终止:当 RNA 链延伸到转录终止位点(终止子) 时,RNA pol 和 RNA 链均从 DNA 模板上释放出来。
Termination signal:Terminator
终止子通常含有自我互补区域 (self-complementary regions) ,在 RNA 产物中可以形成 stem-loop 或 hairpin 结构。
- (1)
-
rho(ρ) 不依赖的终止子
:形成典型的二级结构,在没有 ρ因子 辅助的情况下终止转录。
由两个序列元件组成:
● 一段短的 反向重复序列(大约 20 个核苷酸) ;
● 其后是一段大约 8 个 A:T 碱基对的序列。
由** Rho 非依赖型终止子转录出 mRNA 可形成茎环结构**,可阻止 RNA pol 的前进。
原核生物中转录、翻译以及 mRNA 降解是同时发生的,所以原核生物钟转录和翻译的调控是直接的;真核生物转录后出核才能翻译,是分开的。
-
rho(ρ) 依赖的终止子
:也没有明确定义的二级结构,需要 rho 和 ATP。
rho
: ρ是一种与转录终止相关的蛋白质。ρ是 ATP 依赖性六聚体解旋酶家族的成员。每个亚基具有 RNA 结合结构域和 ATP 水解结构域。 -
ρ因子参与的 RNA 合成终止模式——“穷追”(hot pursuit) 模型
(1) ρ 结合到 RNA 链终止子上游的 rut site;
(2) ρ 因子结合以后延着 RNA 向 3’端移动,跟踪聚合酶;
(3) ρ 追上在终止位点暂停的 RNA 聚合酶;
(4) ρ 因子被 ATP 激活,ATP 水解使得 RNA/DNA 杂合碱基配对不稳定;
(5) RNA 释放。 -
常识数据
● 转录生成 mRNA 的速度大约是每分钟 2500 个核苷酸 (14 个密码子/s),与 翻译速度 (15aa/s)基本相等,但比 DNA 复制的速度要慢得多 (800bp/s)。
● 基因开始表达到转录成 mRNA 的间隔约为 2.5min,而再过半分钟就能在细胞内测到相应的蛋白质。
真核生物 RNA 聚合酶Ⅱ所识别的启动子区
- 核心元件
●TATA box (Hogness 区 )
: -25 ~ -30 bp 区,保守序列为 TATAAA。确定转录起始位点,使转录精确地起始:如果除去 TATA 区或进行碱基突变,转录产物下降的相对值不如 CAAT 区或 GC 区突变后明显,但发现所获得的 RNA 产物起始点不固定。
● 启始子 (initiator,Inr
):转录起始位点附近。 - 上游启动子元件 ( upstream promoter element,
UPE
, 又称 上游激活序列 (upstream activating sequence,UAS
) : TATA 区上游的保守序列。
●CAAT box
: -70 ~ -80 区 CCAAT 序列。
●GC box
: -80 ~ -110 含有 GCCACACCC 或 GGGCGGG 序列。
CAAT 区和 GC 区主要控制转录起始频率,基本不参与起始位点的确定。
- 如何确定调节 DNA 元件
● 在 +1 位点上游分离超过 100bps 的单碱基突变
● 不同基因的上游序列的序列比较
● 构建重叠的缺失突变体
真核生物启动子的特点★★★
(1) 有多种元件:TATA 框,GC 框,CATT 框等;
(2) 结构不恒定。有的有多种框盒,如组蛋白 H2B; 有的只有
TATA 框和 GC 框,如 SV40 早期转录蛋白;
(3) 它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同;
(4) 有的有远距离的调控元件存在,如增强子,这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作用,不直接和 RNA pol 结合。转录时先和其它转录激活因子相结合,再和聚合酶结合。
增强子 enhancer
- 远端上游序列 (far upstream sequence):
增强子 enhancer
在转录起始位点 上游约 200bp 处有 两段 72bp 长的重复序列,它们不是启动子的一部分,但能增强或促进转录的起始,因此,称这种能强化转录起始的序列为增强子或强化子。 - 增强子很可能通过影响染色质 DNA 一蛋白质结构或改变超螺旋的密度而改变模板的整体结构,从而使得 RNA 聚合酶更容易与模板 DNA 相结合,起始基因转录。
增强子的特点
① 具有远距离效应。常在上游 -200bp 处,但可增强远处启动子的转录,即使相距十几 Kb 也能发挥其作用。
② 无方向性。无论在靶基因的上游、下游或内部都可发挥增强转录的作用。
③ 顺式调节。只调节位于同一染色体上的靶基因(不绝对),而对其它染色体上的基因无作用。
④ 无物种和基因的特异性,可以接到异源基因上发挥作用。
⑤ 具有组织的特异性。SV40 的增强子 3T3 细胞中比多瘤病毒的增强子要弱,但 HeLa 细胞中 SV40 的增强子比多瘤病毒的要强 5 倍。增强子的效应需特定的蛋白因图子参与。
⑥ 有相位性。其作用和 DNA 的构象有关。
⑦ 有的增强子可以对外部信号产生反应。如热休克基因在高温下才表达。编码重金属蛋白的金属硫蛋白基因在镉和锌存在下才表达。某些増强子可以被固醇类激素所激活。
- 有 3 类 RNA 聚合酶;
- 结构比大肠杆菌 RNA 聚合酶复杂;
- 在细胞核中的位置不同;
- 负责转录的基因不同,对 α-鹅膏覃碱 的敏感性也不同。
- 真核生物 RNA 聚合酶一般由 8-14 个亚基所组成,相对分子质量超过 5×105。
真核细胞中三类 RNA 聚合酶特性比较
酶 | 细胞内定位 | 转录产物 | 相对活性 | 对α-鹅膏覃碱的敏感程度 |
---|---|---|---|---|
RNA 聚合酶Ⅰ | 核仁 | rRNA(28S, 18S, 5.8S) | 50-70% | 不敏感 |
RNA 聚合酶Ⅱ | 核质 | hnRNA *, snRNA, mRNA | 20-40% | 敏感 |
RNA 聚合酶Ⅲ | 核质 | tRNA, 5SRNA, 某些涉及 RNA 加工的 snRNA | 约 10% | 存在物种特异性 |
*hnRNA
: heterogeneous nuclear RNA, 核内不均一 RNA, RNA 的前体
转录的抑制剂
抑制剂 | 靶酶 | 抑制作用 |
---|---|---|
利福霉素 | 细菌全酶 | 和β亚基结合,抑制起始 |
链霉溶菌素 | 细菌核心酶 | 和β亚基结合,抑制起始 |
放射线素 D | 真核 PolⅠ | 和 DNA 结合,阻止延伸 |
a-鹅膏蕈 | 真核 PolⅡ | 和 RNA PolⅡ 结合 |
- RNA 合成抑制剂主要分两类:
(1) 模板结合抑制剂
(2) 聚合酶抑制剂
真核生物 RNA 聚合酶的主要特征
- 聚合酶中有两个相对分子质量超过 1×105 的大亚基;
- 同种生物 3 类聚合酶有“共享”小亚基的倾向,即有几个小亚基是其中 3 类或 2 类聚合酶所共有的。
- 真核生物 RNA 聚合酶一般由 8-16 个亚基所组成,相对分子质量超过 5×105。
真核生物线粒体和叶绿体中存在不同的 RNA 聚合酶
- 线粒体中 RNA 聚合酶:
● 只有一条多肽链,相对分子量小于 7×105,是已知最小的 RNA 聚合酶之一;
● 与 T7 噬菌体 RNA 聚合酶有同源性。 - 叶绿体中 RNA 聚合酶:
● 比较大;
● 结构上与细菌中的聚合酶相似,由多个亚基组成,部分亚基由叶绿体基因编码。 - 线粒体和叶绿体 RNA 聚合酶活性不受α-鹅膏覃碱所抑制。
- 聚合酶 Ⅱ(RNAP Ⅱ)转录大多数结构基因
- 转录产物是
前体-mRNA
: 转录后加工是广泛的。
RNAP Ⅱ 调节元件
-
核心启动子元件:RNAP Ⅱ 准确转录启动所需的最小 DNA 序列单元。
● BRE: TFⅡB recognition element 识别特殊蛋白的元件
●TATA
: TATA box 5’TATAAA3’
● Inr: Initiator element
● DPE: Downstream promoter element 下游启动元件
-
上游启动子元件 UPE 和增强子/(沉默子): 远离核心启动子区域的 DNA 元件,参与调节基因活性。
●GC
(5’GGGCGG3’) box
●CAAT
(5’GGCCAATCT3’) box
大多数调控元件都在转录 +1 位点上游几百 bps 范围内
RNA polymerase Ⅱ RPB1 的羧基端结构域 (CTD)
- 长的羧基末端尾巴由许多重复的 七肽氨基酸序列-YSPTSPS- 组成。富含 YSP 氨基酸,含羟基,易发生磷酸化。
- 该结构域被 TFⅡH(激酶)/CDK9 等强烈磷酸化。
=> 对于启动子清除/(逃离)很重要
=> 对于转录后加工也很重要:加帽、剪接、加 polyA 尾
基础转录起始事件
-
前起始复合物 (preinitiation transcription complex,
PIC
)
真核生物 RNA 聚合酶 不能直接识别基因的启动子区,需要一些被称为 转录调控因子 的辅助蛋白质按特定顺序结合于启动子上,RNA 聚合酶才能与之相结合并形成复杂的前起始复合物 (PIC) 以保证有效地起始转录。
● GTF: General Transcription factors 包括TBP
(TATA-binding protein), TFⅡA/B/E/F/H
● TFⅡ: DNA binding TFs & RNAP binding TFs
=> Pol Ⅱ-ⅡF form complex
=> Elements/modules
超过** 30 种**蛋白质形成起始复合物,促进转录起始 -
真核生物 RNA 聚合酶Ⅱ转录起始复合物的形成
① TFⅡD (包括 TBP 和 TAFs 即 TATA box) 中的 TBP 绑定到 TATA 框
② TFⅡB 被招募并结合到 BRE(TFⅡB recognifion element)
③ 招募 RNA PolⅡ-TFⅡF 复合物
④ TEⅡE 和 TEⅡH 结合到 Pol 形成完整的转录起始复合物
⑤ 利用 TEⅡH 的 ATP 水解产生的能量 Promoter melting
⑥ Pol Ⅱ 的 CTD 磷酸化,启动子逃离
-
增强子结合激活子
activator
刺激转录
激活子的作用方式
- 激活子与核心转录机器的直接相互作用
- 由共激活因子 (
Coactivator
) 介导的与核心转录机器(通过 TFⅡA, TAF, SRB/mediator )或者核小体(通过 SWI/SNF, HAT) 的间接相互作用。
HAT
通过核小体组蛋白的乙酰化来介导转录激活,导致染色质重塑。
SWI/SNF 复合物
通过以 ATP 依赖性方式促进核小体置换来促进染色质重塑。
TAF
在具有非经典 TATA 元件的基因的转录激活中起作用。
SRB/Mediator
(介体)是 RNA polⅡ 全酶复合物的组分,通过 Rpb1 的 CTD 与 RNA polⅡ 相互作用。
转录延伸
- TFⅡE 和 TFⅡH 在合成前面 60-70nts 的 RNA 后从转录复合物上释放,转录进入延伸。
- 延伸因子
● 增强 PolⅡ 活性,抑制转录过程中的暂停;
● 协调参与 mRNA 转录后加工的蛋白质复合物之间的相互作用。
成熟的 mRNA 结构
- 5’UTR—CDS—3’UTR
UTR
, untranslated sequence 非翻译区
原核与真核生物转录比较
- 原核生物 Prokaryotes:没有转录后修饰,同步转录和翻译
- 真核生物 Eukaryotes: 转录和翻译在不同位置
- 转录后修饰:1)5’-cap;2)3’-tail;3)Intron Splicing
原核生物与真核生物 mRNA 的特征比较
-
原核生物 mRNA 的特征
(1) 半衰期短:大多数细菌 mRNA 在转录开始 1min 后就开始降解。mRNA 降解的速度大概只有转录或翻译速度的一半。
(2) 许多原核生物 mRNA 以 多顺反子 的形式存在:原核细胞的 mRNA(包括病毒)可以同时编码几个多肽。
单顺反子
mRNA(monocistronic mRNA): 只编码一个蛋白质的 RNA。
多顺反子
mRNA(polycistronic mRNA): 编码多个蛋白质的 mRNA。
(3) 原核生物 mRNA 的 5’端无帽子结构,3’端没有或只有较短的多聚 (A) 结构。
原核生物起始密码子 AUG
上游有一被称为 Ribosome Binding Site (RBS
) 或 SD 序列 (Shine-Dalgarno sequence)的保守区,因为该序列与 16S-rRNA 3’端反向互补,所以被认为在核糖体-mRNA 的结合过程中起作用。
(4) 原核生物常以 AUG(有时 GUG,甚至 UUG) 作为起始密码子(A/G/UUG); 真核生物几乎永远以 AUG 作为起始密码子(也可以是 GUG/UUG,只是起始效率低)。 -
真核细胞 RNA 转录
-
真核生物 mRNA 的特征
单顺反子形式存在。
5’端存在“帽子”结构(甲基化的鸟苷/三磷酸腺苷,CH3-G-PPP-mRNA 序列)。
绝大多数具有 polyA 尾巴。
真核生物转录后加工过程
(1) pre-mRNA 的 5’端“加帽”。
当新生 RNA 的 长度约为 20-30nt 时,通过加帽酶将甲基化的帽结构加到转录物的 5‘末端,该结构保持在整个 mRNA 成熟和翻译过程。
● 通过 5’→5’磷酸二酯键在原初 mRNA 的 5’端 倒扣一个“G”。
● 包括三个连续的酶促反应。(磷酸基团之间形成磷酸二酯键)
● 5’末端加上鸟苷是由鸟苷转移酶催化的。
● 帽子结构是 GTP 和原 5’三磷酸腺苷(或鸟苷)缩合反应的产物。
● mRNA 的帽子结构常常被甲基化,是 蛋白质合成起始信号 的一部分。
● 帽子结构的功能:
(1) 有助于 mRNA 越过核膜,进入胞质;
(2) 保护 5’ 不被核酶降解;
(3) 翻译时供 IFⅢ(起始因子) 和 核糖体识别,对翻译起始很重要。
(2) pre-mRNA 的加 Poly(A) 尾巴过程
● 除组蛋白基因外,真核生物 mRNA 的 3’末端都有 Poly(A) 尾巴
● Poly(A) 被特异的蛋白质 PABP (PolyA 结合蛋白) 结合
● 许多非编码 RNA (microRNA, long noncoding regulatory RNAs) 也有 Poly(A) 尾巴
● 真核生物中没有终止子序列
● 在高等生物中(酵母除外)在 poly(A) 上游 11-35nt 处有一高度保守的特殊序列 AAUAAA
, 能使转录停止。
● 对于初级转录产物的准确切割及加 Poly(A) 是必需的。
● 大约 50-200 个 A 加到末端。
● 参与加尾的蛋白:
CPSF
: cleavage & polyadenylation specificity factor, AAUAAA→转录暂停CstF
: cleavage stimulation factor, 与富含 GU 或 U 的序列结合;与 CPSF 相互作用并形成环;CPSF 转移至 RNAPⅡCTDCFⅠ & CFⅡ
: cleavage factors, 在 切割位点 UGUAA 附近结合- Poly(A) polymerase (
PAP
): 与 CPSF 结合,增加 RNA 结合亲和力,催化加 A - Poly(A) binding protein Ⅱ (
PABⅡ
): 结合生长中的 polyA 尾;增加 PAP 对 mRNA 的亲和力及其持续性。PABⅡ 仍与 Poly (A)尾部结合,促进翻译起始。
● RNAPⅡ 转录终止过程:
RNAPⅡ 相关的 CPSF 扫描前 mRNA,与 AAUAAA 结合,CPSF 作用于聚合酶体,导致 RNAPⅡ 暂停,然后终止转录。
● 聚腺苷酸化和转录终止:
① CPSF 和 Cstf 与 poly-A 信号结合,导致转录终止,CFⅠ/CFⅡ 切割 RNA。
② Poly-A 聚合酶 (PAP) 在 RNA 的 3’末端先添加 ~10As。该过程依赖于 AAUAAA 序列。
③ (PAP) 以 ATP 作为底物,在 RNA 的 3’末端再添加 ~200As。该过程与 AAUAAA 序列无关。
● Poly(A) tail 长度控制
- 在 ~250nt poly(A) 时,PAB2/ PAP/ poly(A) 结构会破坏 CPSF-PAP-PAB 复合物。
- 对 RNA 的亲和力低,聚腺苷酸化停止
● Poly(A) 的功能
- 是 mRNA 由细胞核进入细胞质所必需的形式
- 保护 mRNA,防止 mRNA 在细胞质中被酶降解。mRNA 刚从细胞核进入细胞质时,其多聚 (A) 尾巴一般比较长,随着 mRNA 在细胞质内逗留时间延长,Poly(A) 逐渐变短消失,mRNA 进入降解过程。
- 有助于转录终止;
- 它可促进翻译的起始以及核糖体的有效循环。
● mRNA 的降解
- poly(A) 核糖核酸酶(
PARN
)可以结合 5’帽并从 poly(A) 尾去除核苷酸 - 去除 poly(A) 尾后,去盖复合物 (the decapping complex) 去除 5’帽,导致 RNA 降解。
● 选择性多腺苷酸化——调节 mRNA 的寿命
- 产生不同的编码 mRNA
- 小 RNA 促进它们结合的 mRNA 的降解,并抑制翻译
- 由于选择性多腺苷酸化可以改变 3’非翻译区的长度,它可以影响 microRNA 与 3’非翻译区的结合位点。
poly(A) 位点的选择取决于参与多腺苷酸化的蛋白质的表达。
(3) 内含子的剪接、编辑及化学修饰★★★
● 内含子的发现 (β-globin gene)——R-looping 实验
(1) 杂交成熟 mRNA(10S) 与其基因发现 一个以上的 R-环 和双链 DNA 环
(2) 将前体 mRNA(15S) 与其基因杂交仅发现一个连续的 R-环
结论:基因序列与其基因产物的氨基酸序列不完全匹配。
R-环
:成熟 mRNA 与其 DNA 编码序列的杂交-置换单链 DNA 的环。- 异质核 RNA (
hnRNA
): 细胞核中的前体 mRNA
● 外显子 Exons
: 成熟 mRNA 中出现的编码序列。
● 内含子 Introns
: 在 mRNA 前体分子中被切除的非编码区的序列。断裂基因的存在证明基因可能比编码蛋白质的单位大得多。
-
外显子序列更保守,但内含子不同。随着基因组大小的增加,趋势是内含子变得更大,而外显子仍然很小。
-
真核基因平均含有 8-10 个内含子,前体分子一般比成熟 mRNA 大 4-10 倍。
-
外显子的序列、排布具有保守性
-
一个基因的内含子可以编码另一个基因。不一定是编码蛋白基因,也可以是 RNA 基因。
★ RNA 剪接 Splicing
:去除内含子和连接外显子。
- 在成熟 mRNA 输出到细胞质之前,发生在细胞核中。剪接体(RNA +蛋白)催化。
- 外显子突变影响蛋白质序列;内含子突变可影响 RNA 的加工并因此阻止蛋白质的产生。
- 影响拼接的突变通常是有害的。大多数是内含子和外显子之间连接处的单碱基替换。
- 导致人类疾病的约 15%的点突变是由剪接破坏引起的。地中海贫血病人的珠蛋白基因中,大约有 1/4 的核苷酸突变发生在内含子的 5’或 3’边界保守序列上,或者直接干扰了前体 mRNA 的正常剪接。
● 内含子切割位点的特点:
(1) 内含子的两个末端不存在同源或互补。
(2) 连接点具有很短的保守序列, 亦称 边界序列。100 种内含子的 5’端都是 GU;3’端都是 AG,因此称为 GU-AG 法则(GU-AG rule),又称为 Chambon 法则。Note: GU-AG 法则(GU-AG rule)不适用于线粒体、叶绿体的内含子,也不适用于酵母的 tRNA 基因。
● 核前体 mRNA 内含子结构特点
① 保守的边界序列:其边界序列是完全符合 GU-AG 法则;
② 3’剪接位点 AG 附近有一段富含密啶的区域(10-20 nt);
③ 分枝点序列 Branch site
:具有分枝点序列,位于内含子 3’端上游 18-50nt 处,序列为 Py80NPy87Pu75APy95, 其中 A 为百分之百的保守,且具有 2’-OH;
④ 5’保守序列 GUPuAGU,保守序列 (5’GUAAGUA3’) 可以和 U1 snRNA(剪接体中的一种细胞核小 RNA)的 5’端的保守序列 3’CAUUUCAU5’互补。
● pre-mRNA 剪接的步骤
- Step 1: 5’ splice site 发生切割
- Step 2: 3’ splice site 切割,产生具有 5’-2’ bond 的套索结构中间体(5’切出来的连接点处的** G 与分支点序列中的 A **结合形成)
★ 核 pre-mRNA 的剪接的调控因子:剪接体 Spliceosome
-
催化 pre-mRNA 的核内剪接
-
剪接体
由大约 150 个蛋白质(剪接因子等)和 5 个 snRNAs(U1,U2,U4,U5 和 U6) 以及被组装的 pre-mRNA 组成。 -
细胞核中的小分子 RNA 称为细胞核小 RNA (small nuclear RNA,
snRNA
); The complexes of snRNA and proteins are called small nuclear ribonuclear proteins (snRNP
,核小核糖核蛋白) -
snRNP 在剪接中的三个作用
(1)识别 5’剪接位点和分支位点。
(2)将这些位点拉到一起。
(3)催化(或帮助催化)RNA 断裂。
RNA-RNA,RNA-蛋白质和蛋白质-蛋白质相互作用在剪接过程中都很重要。
-
真核生物 mRNA 前体内含子的剪接过程
① 由 U1 snRNA 以碱基互补的方式识别 mRNA 前体 5’剪接点,由结合在 3’剪接点上游富嘧啶区的 U2AF (U2 auxiliary factor)识别 3’剪接点并引导 U2 snRNP 与分支点相结合,形成剪接前体(pre-spliceosome
)。
② 剪接前体进一步与 U4、U5、U6 snRNP 三聚体相结合,形成剪接体。
-
哺乳动物细胞中 mRNA 前体上的 snRNP 是从 5’向下游“扫描”,选择在分支点富啶区 3’下游的第一个 AG 作为剪接的 3’受点。
-
AG 前一位核苷酸可以影响剪接效率,一般说来,CAG=UAG>AAG>GAG。
-
如果 mRNA 前体上同时存在几个 AG,可能发生剪接竞争。
● 一些 DNA 序列编码多种蛋白质
(1)重叠基因:其中一个基因是另一个基因的一部分(包含关系)。Alternative initiation and alternative termination
(2)共享序列:两个基因部分重叠。Alternative open reading frame.
(3)选择性剪接:Alternative splicing.
● RNA 剪接的 5 种模式
★ 内含子的选择性剪接 Alternative Splicing
- 在高等真核生物个体发育或细胞分化过程中可以有选择性地越过某些外显子或某个剪接点进行选择性剪接,产生出组织或发育阶段特异性 mRNA。
- 脊椎动物中大约有 5%的基因能以这种方式进行剪接,保证各同源蛋白质之间既具有大致相同的结构或功能域,又具有特定的性质差异,进而拓展了基因所携带的遗传信息。
- 最好的例子是果蝇唐氏综合征细胞粘附分子(Drosophila Down syndrome cell adhesion molecule, Dscam,唐氏综合征细胞粘附分子)基因,果蝇 DSCAM 基因可以以 38,000 种选择性方式进行剪接。
★ 内含子(Introns)
① pre-mRNA introns(GU-AG、AU-AC)
② tRNA genes 中的内含子:由切割 RNA 的酶去除;蛋白激酶重新连接 tRNA 的两半
③ Ⅰ类内含子(group Ⅰ introns)
④ Ⅱ类内含子(group Ⅱ introns)
★ 自我剪接内含子(Self-splicing introns)——Ⅰ、Ⅱ类内含子:带有这些内含子的 RNA 本身具有酶的催化活性,能进行内含子的自我剪接。
-
Ⅰ类内含子 (group Ⅰ intron)
① 其边界序列为 5’U-G3’
② 内含子中具有中央核心结构(中央核心结构,包含鸟嘌呤结合口袋和内部指导序列)
· 存在于线粒体、叶绿体、非脊椎动物的核基因组中的 mRNA, tRNA 和 rRNA 中,也存在于噬菌体以及真细菌基因组中。
· 自我剪接过程:两次磷酸二酯键的转移。
-
Ⅱ类内含子 (group Ⅱ intron)
· 和Ⅰ类内含子剪接不同;Ⅱ类内含子的剪接无需鸟苷(GTP)的辅助,但需 Mg 离子的存在。
· 与核 mRNA 内含子的剪切有些相似,但也有不同之处。Ⅱ类内含子剪接的化学反应和产生的 RNA 中间体与核前体 mRNA 相同;· 分布:found in mitochndria and chloroplasts, cyanobacteria(蓝藻)and proteobacteria(变形细菌)
· 自我剪接过程:形成套索 (lariat) 结构
★ 三类剪接反应
- 核** pre-mRNA 的剪接体**、Ⅰ类内含子的自我剪接、Ⅱ类内含子的自我剪接
- 共性:三类剪接反应都是通过 两次连续的转酯反应 进行的。
· 第一次转酯反应中,由一个游离的 2’-OH 提供,发动对 5’外显子-内含子连接点的攻击。
· 第二次转酯反应中,已经释放的外显子末端的游离 3’-OH 接着攻击 3’内含子-外显子的连接点。
pre-mRNA 加工和转录同时进行,剪接与转录的协调作用将两个剪接位点组合在一起。
RNA 的编辑 (RNA editing)
★ RNA 编辑 (RNA editing)
是指转录后的某些 RNA,特别是 mRNA,在编码区发生 碱基的加入、丢失或转换 等现象。
- RNA 编辑具有校正、调控翻译、改变遗传信息等功能。
★ RNA 的编辑的两种机制
- 位点特异性 脱氨基 作用:mRNA 中的 C 残基被特异性脱氨酶转化为 U。该过程仅在某些组织或细胞类型中以受调控的方式发生。
· 哺乳动物载脂蛋白 B 基因转录产物的编辑:肠中转氨酶活性强,导致发生 mRNA 编辑 CAA>UAA(终止子),最终编码蛋白 Apro-B100 变成 Apo-B48。
- 尿苷酸 U 的缺失和插入:引导 RNA(guide RNA)指导的 尿嘧啶插入或删除。
· 研究发现,利什曼原虫属细胞色素 b mRNA 中含有许多独立于核基因的尿密啶残基,而特异性插入这些残基的信息来自指导 RNA(guide RNA)。
★指导 RNA(guide RNA, gRNA)
· 1990 年,L.Simpsom 等在研究锥虫线粒体 mRNA 时发现了一类新的小分子 RNA,可以和 mRNA 分子被编辑的部分发生非常规的互补——G-U 配对,对 mRNA 前体分子的编辑起了指导作用,故称其为指导 RNA(gRNA)。
· 含有三个区域
① 锚定 UGGA, 将 gRNA 指向它将编辑的 mRNA 区域。
② 编辑区域 AACAUA 确定 Us 插入位置
③ poly-U 拉伸
· gRNA 和 mRNA 的编辑机制
gRNA 与 mRNA 被编辑区及其周围部分核酸序列虽然有相当程度的互补性,但该 RNA 上存在一些未能配对的腺嘌呤 A,形成缺口,为插入尿嘧啶 U 提供了模板。
反应完成后,gRNA 从 mRNA 上解离下来,而 mRNA 则被用做翻译的模板。
mRNA Transprot 转运
- 一旦加工完毕,mRNA 就会被包装并从核孔中输出到细胞质进行翻译。
- 一组特殊的 RNA 结合蛋白标示 mRNA 已成熟,可以运送到细胞质中。
- 从细胞核移动到细胞质是一种积极而受调控的过程。
- 受损、错误加工和释放的内含子保留在核内被降解。
- 一旦进入细胞质,一些蛋白质被丢弃,然后导入核内再次进行 mRNA 转运。一些蛋白质留在 mRNA 上以促进翻译。
- 大多数真核生物 rRNA 基因无内含子。有些虽然有内含子但并不转录。
● 核糖体 RNA (rRNA) 的产生需要切割反应
· 大小 rRNA 都通过从共同的 RNA 前体切割下来而释放的。
· 5’端大多直接由切割产生,3’端大多由切割及其后的 3’-5’修整反应产生的。
· 以人 HeLa 细胞为例,哺乳动物细胞内 rRNA 前体的剪切过程包括以下 4 个步骤:
(1) 在 5’端切除非编码的序列,生成 41S 中间产物。
(2) 41S RNA 再被切割为两段,一段为 32S, 含有 28S rRNA 和 5.8S rRNA, 另一段为 20S, 含有 18S rRNA。
(3) 32S RNA 进一步被剪切成 28S rRNA 和 5.8S rRNA。
(4) 20S RNA 被剪切生成 18S rRNA。
● 真核生物 tRNA 基因有内含子,其前体必须经过剪接。
● 其内含子的特点:
① 长度和序列没有共同性,一般有 16~46 个核苷酸;
② 位于 反密码子 的下游;
③ 内含子和外显子间的边界没有保守序列,所以与 mRNA 的剪接不同,tRNA 前体的剪接不符合一般规律。
● tRNA 由较长的前体加工而来
由于 tRNA 分子具有高度保守的二级结构,真核生物 tRNA 前体内含子的精确切除信号是 tRNA 分子共同的二级结构。哺乳动物、酵母,果蝇和植物等的 tRNA 的加工基本上相同。
endonuclease 核酸内切酶;exonuclease 核酸外切酶
- 加工过程:
(1) 内含子的剪接:tRNA 核酸内切酶切割前体分子中的内含子,RNA 连接酶将外显子部分连接在一起。tRNA 的切割和连接是独立的反应,内含子的剪接由 tRNA 核酸内切酶和 RNA 连接酶完成;
(2) 3’端添加 CCA:是在 tRNA 核苷酸转移酶的催化下进行的。真核生物所有 tRNA 前体的 3’端缺乏-CCA-OH 结构,在蛋白质翻译过程中没有活性,因而需要在 tRNA 核苷酸转移酶的催化下在其 3’端添加 CCA。
(3) 核苷酸修饰:tRNA 分子中稀有核苷酸较多,其修饰很频繁。如 tRNA 甲基化酶能够催化 tRNA 分子特定位置的甲基化等,但这些稀有核苷酸的功能还有待深人研究。
RNA as Catalysts(催化剂)——核酶(ribozyme)
-
1989 年诺贝尔化学奖:发现 RNaseP 中的 RNA 组分能催化 tRNA 前体的加工。
-
核酶(ribozyme)
:是指一类具有催化功能的 RNA 分子,通过催化靶位点 RNA 链中磷酸二酯键的断裂,特异性地剪切底物 RNA 分子,从而 阻断基因的表达。 -
核酶的分类
① 剪切型核酶:只剪不接;如 RNaseP 的 RNA 亚基,四膜虫 RNA 前提的剪接产物 L19 等。
② 剪接型核酶:又剪又接,具有序列特异的内切核酸酶、RNA 连接酶等多种酶的活性。如 Ⅰ、Ⅱ类内含子、锤头型核酶、发夹型核酶等。 -
核酶(ribozyme)的催化功能与其空间结构有密切关系。
核酶的锤头结构(hammerhead structure
):具有自我剪切能力的 RNA 大都能形成锤头结构。
· 该酶包括三个茎环区,其间有一个 11-13 个保守核苷酸构成的催化中心。N 代表该位置上可以为任意碱基。在类病毒中,茎Ⅲ的顶部并没有被环连接起来。
· 当酶链被引入细胞时,它可与底物链配对,并将其切割。
· 核酶的发现为基因治疗提供了新的策略,因为根据其自我剪接的特点,可以人工合成多种核酶以抑制破坏病毒或癌基因等有害基因的功能。 -
核酶(ribozyme)的生物学意义
① 核酶的发现使我们对 RNA 的重要功能又有了新的认识。
② 核酶是继逆转录现象之后对中心法则的又一个重要修正,说明 RNA 既是遗传物质又是酶。
③ 核酶的发现为生命起源的研究提供了新思路,也许曾经存在以 RNA 为基础的原始生命。照这么说,蛋白质世界也可能(仅仅是可能)起源于 RNA 世界!
欢迎分享,转载请注明来源:内存溢出
评论列表(0条)