怎样在genbank基因库中找出我需要的基因序列啊

摘 要：为探讨甲醛致大鼠鼻腔癌的分子机制，对甲醛诱发的大鼠鼻腔癌细胞系FAT7中的转化序列进行检测。采用的实验方法，包括肿瘤细胞DNA与选择标志基因(neo)共转染、裸鼠成瘤性分析、Southern杂交、聚合酶链反应(PCR)和序列分析等。结果发现：在第二轮裸鼠肿瘤DNA中含有大鼠源性的K-ras基因序列，而无大鼠源性的H-ras、N-ras和p53基因序列。这表明甲醛诱发的大鼠鼻腔癌细胞系FAT7中所含的转化序列与H-ras、N-ras及p53基因无关，K-ras癌基因的活化可能参与甲醛致大鼠鼻腔癌。

关键词：甲醛；大鼠：鼻腔癌；K-ras：癌基因

中图分类号：R730

文献标识码：A

文章编号：1007―7847(2006)01―0071―06

甲醛是一种工业用途十分广泛的化学物质， 在人们日常生活环境中也大量存在。对甲醛的 致癌性进行流行病学、毒理学、病理学研究，发现 甲醛可引起染色体异常、基因缺失、基因突变、细 胞转化，长期慢性吸人甲醛可诱发动物肿瘤等， 但甲醛致癌的具体机制迄今仍不清楚，因此甲醛 被列为潜在致癌物。为了探讨甲醛致癌的分子机 制。本文采用DNA共转染与裸鼠成瘤性分析相结 合的方法，对来自甲醛诱发的大鼠鼻腔癌细胞系 FAT7中的转化序列进行了检测和初步鉴定。

1 材料与方法

11 细胞系、质粒及裸鼠

甲醛诱发的大鼠鼻腔癌细胞系FAT7由陈主 初教授在美国化学工业毒理学研究所(Clit)建立 并带回，小鼠成纤维细胞系NIH3T3(CRL―1659) 购自美国典型培养物中心(ATCC)，人膀胱癌细胞 系T24及质粒pkjl・neo由本所保存。裸小鼠 (BALB／Cnu／nu)购自中国科学院上海实验动物 中心。

12 主要试剂

胎牛血清，培养基DMEM、RPMll640均系美 国Hyclone公司产品；分子生物学试剂，如随机引 物标记试剂盒、PCR试剂盒、限制性核酸内切酶、 低熔点琼脂糖等购自美国promega公司；DNA回 收试剂盒为上海生工公司产品；转染试剂Fu- GENTM6和G418购自美国Roche公司；同位素 a-32P-dCTP(3000ci／mm01)购自北京亚辉公司。 其它常用试剂均为国产分析纯。

1．3 方法

1．3，1 DNA的提取和Southern杂交

质粒／真核细胞DNA的提取、酶切、电泳以 及Southem杂交均参照文献的方法，探针回收 和标记则按试剂盒说明书进行。

1．3，2 DNA共转染、G418筛选与棵鼠成瘤性 分析

转染前24h，接种约5x105NIH3T3细胞于 100mm平皿中培养过夜．转染时，先取3个含有 770 1xL无血清DMEM的聚丙烯酰胺试管，分别 于每管中加入30μL脂质体转染试剂，并轻轻混 匀；同时于另外3个含有800 μL无血清DMEM 的聚丙烯酰胺试管中分别加入FAT7、NIH3T3、 T24细胞基因组DNA各30 ixg和pkj1-neo质粒 DNA各300ng，同样轻轻混匀。再将加入了脂质 体转染试剂的试管分别与加入不同细胞DNA试 管中的液体混合，室温下静置15min。然后，用无 血清DMEM给待转染的细胞换液，并将上述混合 液加入到含有4mL无血清DMEM的细胞培养皿 中，轻轻混匀后置37℃ C02培养箱孵育，6h后，补 加5，6mL含20％胎牛血清的DMEM培养过夜。

转染72h后，用胰酶消化转染细胞，并按1：5 传代培养，同时在培养基中加入G418(终浓度为 400mg／L)进行筛选，以后每隔2d换一次筛选培 养基(含G418，300mg／L)。约8～10d左右，转染 细胞出现抗性克隆，而未转染的NIH3T3细胞，筛 选10d后全部死亡。继续筛选1～2周后，每个 平皿中约有300个抗性克隆，此时再用胰酶消化 细胞，并将每组细胞集中(每组抗性克隆数≥1 000)，细胞计数后接种于4周龄裸小鼠(BALB／c nu／nu)右腋窝皮下，(每只0．5 mL，107个细胞)， 当肿块超过1 cm×1cm后，处死荷瘤裸鼠，切下 肿块供进一步分析

1．3．3 PCR扩增及序列分析

本研究使用的引物名称、序列及扩增产物大 小见表1。其中，引物3B5U／3B5L针对大鼠特异 性高度重复序列3B5，参照文献设计，用于 Southern杂交的探针标记；N-rasE2U／N-rasE2L用 于检测大鼠N－ras基因外显子2，参照文献设 计：引物H－raselU／H-rasElL和K-rasElU／ K-rasElL，分别用于大鼠H-ras和K-ras基因外显 子1的检测，系根据GenBank中相应序列用 Primer3．0软件自行设计，以上引物均由上海生工 技术服务有限公司合成，引物p53E5U／p53E5L 针对大鼠p53基因外显子5，参照文献设计，用 于大鼠p53基因的检测，由本室保存。

PCR反应体系均为50μL，其中DNA模板l jxL，10X PCR反应缓冲液5 μL，200 mmol／L dNTPs 1μL，401xmol／L上、下游引物混合液0，5 μL。Taa酶5U．PCR反应条件，对于3B5探针标 记和Ha-ras基因检测来说，均为：预变性95℃ 5min，变性94％50s，退火55℃ 30s，延伸72℃ lmin，循环30次，72℃延伸7min。而对于 N-ras、p53和K-ras基因的PCR，虽然变性和延伸 的条件与上述相同，但退火的条件则各有不同， N-fas为45℃ 30s，p53为57℃ 30s，而K-ras则 为58℃ 30s。

PCR反应完毕后，取5μL产物于1．5％的琼 脂糖凝胶中电泳，EB染色照相。PCR扩增产物由 上海申友生物技术有限公司纯化并测序，测得的 序列经Intemet用BLASTn软件与GenBank数据 库进行序列同源性比较分析。

2 实验结果

2．1 细胞DNA共转染及裸鼠成瘤性分析

取甲醛诱发的大鼠鼻腔癌细胞系FAT7的 基因组DNA为供体，并以人膀胱癌细胞系T24 (含有活化的人，H-ras基因)和小鼠成纤维细胞 系NIH3T3(转染受体细胞)的基因组DNA分别 作为阳性对照和阴性对照，与含选择标志基因 (Neo)的质粒plj1―neo共转染NIH3T3细胞，经 G418筛选转染细胞，获得的G418抗性细胞克隆 (≥1000)分别接种裸鼠，进行裸鼠成瘤实验，结 果见表2．如表2所示，实验组(FAT7细胞DNA 与Neo共转染)8只裸鼠中有3只接种部位出现 肿块，出现时间为接种裸鼠后1个月左右，生长速 度较慢，肿块长成I cmxl cm需2周左右，病理 切片可见为低分化纤维肉瘤(结果未示出)；阳性 对照组(T24细胞DNA与Neo共转染)4只裸鼠 全部长瘤且出现较早(不到14d)，生长迅速，仅需 3～4 d即可长至1cm×1cm；阴性对照组 (NIH3T3细胞DNA与Neo共转染)所有接种裸鼠 则不长瘤。将实验组获得的裸鼠肿瘤，按照成瘤 时间的先后顺序命名为FAT7―1，FAT7-2，FAT7-3． 随后从裸鼠肿瘤组织中提取基因组DNA，并与大 鼠特异性高度重复序列3B5探针进行Southern杂 交，结果发现实验组3个裸鼠肿瘤DNA中均含有 大鼠源性序列，其中FAT7-1和FAT7―3的杂交信 号较强(图1)。

2．2 肿瘤DNA共转染及裸鼠成瘤性分析

选择与3B5探针杂交信号较强的FAT7―l和 FAT7-3裸鼠肿瘤DNA作为供体，同样以人膀胱 癌细胞系T24和小鼠成纤维细胞系NIH3T3的基 因组DNA分别作为阳性对照和阴性对照，依前述 方法进行第二轮DNA共转染和裸鼠成瘤性分析， 实验结果见表3。通过第二轮DNA共转染和裸鼠 成瘤性分析，发现实验组(FAT7―1和FAT7／-3肿瘤 DNA与Neo共转染)所接种的6只裸鼠全部在接 种部位出现肿块，但肿瘤出现的时间仍在接种裸 鼠后1个月左右，生长速度较慢，肿块长成1 cm×1cm需两周左右，由病理切片可见也是低分 化纤维肉瘤(结果未示出)。这提示第二轮DNA 共转染和接种裸鼠后形成的肿瘤中相关转化序列 可能已富集，但其转化活性仍偏弱，随后，用3B5 探针与第二轮所获裸鼠肿瘤DNA进行Southern 杂交，结果表明：第二轮裸鼠肿瘤DNA中确实含 有大鼠源性的3B5序列，且含有3B5序列的肿瘤 DNA片段明显集中，说明转化序列已相对富集 (图2)，可进行相关转化基因的克隆及鉴定。

2．3 裸鼠肿瘤DNA中转化相关序列的初步 鉴定

为了鉴定．与甲醛诱发大鼠鼻腔癌相关的转化 序列，以在化学诱癌过程中突变频率较高的ras 癌基因家族(包括H-fas、N-ras、K-ras)为靶基因， 对第二轮裸鼠肿瘤DNA进行了PCR扩增+结果 发现，第二轮裸鼠肿瘤DNA中无大鼠源性的 H-fas和N-ras基因序列(图3、4)；而由于大、小鼠 K-fas基因外显子1序列高度同源的缘故，在第二 轮裸鼠肿瘤DNA和作为PCR阴性对照的NIH3T3 未转染细胞DNA及作为PCR阳性对照的FAT7／细 胞DNA中，均扩增出了大小一致的PCR产物带 (图5)。为了进一步确定第二轮裸鼠肿瘤DNA中 K-ras基因序列是否为大鼠来源，将上述针对K-ms 基因外显子1的PCR产物，回收后直接测序，并将 测得的序列与GenBank数据库进行BALST分析， 结果发现第二轮裸鼠肿瘤DNA中确实含有大鼠源 性的K-ras基因外显子1序列，但该段序列除在第3 位密码子有一个同义突变(GAA―GAG)外，并无 其他有意义的突变(图6)。

3 讨论

肿瘤DNA与选择标记基因共转染及裸鼠成 瘤性分析方法，是表型克隆的一种，其基本技 术路线是将外源DNA导入正常受体细胞并使之 发生转化，产生恶性表型，再从转染细胞中筛 选、克隆出起转化作用的DNA序列。迄今已知 的大多数转化基因(癌基因)都是用这种方法克 隆得到的。本研究以甲醛诱发的大鼠鼻腔癌细 胞系FAT7作为DNA供体，用该方法检测与甲醛 致大鼠鼻腔癌相关的转化序列，结果发现；在第一 轮接种的实验组裸鼠中，8只裸鼠仅有3只长出 肿瘤；而第二轮接种的实验组裸鼠中，6只裸鼠全 部长出肿瘤，提示经第一轮筛选后，转化相关序 列已经相对富集．我们用大鼠特异性高度重复序 列3B$作为探针检测第一、二轮裸鼠肿瘤DNA， 也证实经过两轮的DNA共转染和裸鼠成瘤实验 筛选，裸鼠肿瘤DNA中大鼠源性序列确已高度富 集，可进行转化相关基因的鉴定及分析。

遗传毒理学研究表明：甲醛对核酸、蛋白质 等生物大分子的氨基(NH2)具有活泼的反应性， 可与之共价结合，形成不稳定的甲基化加合物，并 进一步转变成稳定的DNA-DNA、蛋白质－DNA甲 叉交联，后者是一种不可逆的遗传学改变。一般 认为，化学致癌的起始事件是DNA特异部位加合 物的形成，如在细胞分裂前DNA损伤未得到及时 修复，则发展为基因突变，从而导致癌基因活化 和／或抑癌基因失活。由于甲醛能与DNA等生 物大分子形成加合物，造成不可逆的、稳定的遗传 学损害，说明在甲醛致大鼠鼻腔癌的过程中可能 涉及到某些转化基因的突变。鉴于在化学致癌的 研究中，ira3癌基因家族(H-ras、N-ras、K-ras)的突 变频率较高，而且DNA共转染及裸鼠成瘤性 方法对检测活化的raS癌基因极为敏感，因此首 先分析了转化序列与ras癌基因家族的关系。另 外，由于曾经发现甲醛所致大鼠鼻腔癌及其相应 细胞系FAT7中p53基因外显子5第271密码子 有CGT→CAT(Cys--4His)的突变，对转化序列是 否与p53基因相关也同时进行了研究(结果未示 出)，通过PCR扩增，发现在第二轮裸鼠肿瘤 DNA中只含有K-ras癌基因的相应产物，而无 H-ras、N-fas和p53基因相应的产物。但由于 PCR引物位于K-ras基因外显子1(序列较为保 守)的缘故，在第二轮裸鼠肿瘤DNA和作为PCR 阴性对照的NIH3T3未转染细胞DNA及作为 PCR阳性对照的FAT7细胞DNA中，均扩增出了 大小一致的PCR产物，因此对PCR产物进行了测 序。序列分析的结果显示：第二轮裸鼠肿瘤DNA中 的确含有大鼠K-ras基因外显子1序列，不过该段 序列并未发现有意义的突变。这提示，我们检测到 的转化相关序列可能与大鼠H-ras，N-ras及p53基 因无关，而极有可能是大鼠K-ras癌基因，但鉴于 裸鼠肿瘤DNA中K-ras基因外显子1无任何有意 义的突变，故在甲醛致大鼠鼻腔癌的过程中K-ras 癌基因的作用及其活化机制仍有待进一步研究。 本文为全文原貌 未安装PDF浏览器用户请先下载安装 原版全文

Genbank库包含了所有已知的核酸序列和蛋白质序列，以及与它们相关的文献著作和生物学注释。它是由美国国立生物技术信息中心(NCBI)建立和维护的。它的数据直接来源于测序工作者提交的序列；由测序中心提交的大量EST序列和其它测序数据；以及与其它数据机构协作交换数据而来。Genbank每天都会与欧洲分子生物学实验室(EMBL)的数据库，和日本的DNA数据库(DDBJ)交换数据，使这三个数据库的数据同步。到1999年8月，Genbank中收集的序列数量达到460万条，34亿个碱基，而且数据增长的速度还在不断加快。Genbank的数据可以从NCBI的FTP服务器上免费下载完整的库，或下载积累的新数据。

NCBI还提供广泛的数据查询、序列相似性搜索以及其它分析服务，用户可以从NCBI的主页上找到这些服务。

1打开GenBank数据库，界面如下：

2点击Entrez，进入Entrez界面，界面如下：

3在search across databases框中输入要下载的资料名称，如rbp4，得到下面的结果：

4点击第二个标签，出现下面的结果：

5点击Full Text 就得到想要的文献，如下：（这里只截取了一部分）

以上就是关于怎样在genbank基因库中找出我需要的基因序列啊全部的内容，包括:怎样在genbank基因库中找出我需要的基因序列啊、《自然》评选改变科学的10个计算机代码项目、[甲醛致大鼠鼻腔癌与K－ras癌基因活化相关]K-ras等相关内容解答，如果想了解更多相关内容，可以关注我们，你们的支持是我们更新的动力！