AllelelID 6.0_多倍体物种的qpcr 引物设计

AlleleID 软件是一款可用于细菌鉴定，病原体检测以及物种鉴定的综合性桌面工具。通过以ClustalW为核心的多序列比对方法，AlleleID 可以设计用于物种鉴定/跨物种分析的基因芯片探针以及用于实时PCR的SYBR Green， TaqMan MGB， TaqMan 探针， 分子信标以及实时PCR引物。AlleleID 也支持检测可变剪切片段的基因芯片实验的设计。

AlleleID 60软件分享给各位科研筒子们。

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RT-qPCR简介

RT-qPCR逆转录过程

RT-qPCR 的 qPCR 过程

定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, RT-qPCR）是应用于以RNA作为起始材料的PCR实验中的一种实验方法。在该方法中，总RNA或信使RNA（mRNA）首先通过逆转录酶转录成互补DNA（cDNA）。随后，以cDNA为模板进行qPCR反应。RT-qPCR已被用于多种分子生物学的应用中，其中包括基因表达分析、RNA干扰验证、微阵列验证、病原体检测、基因测试和疾病研究。

RT-qPCR可通过一步法或两步法来完成（图1、表1）。一步法RT-qPCR把逆转录与PCR扩增结合在一起，使逆转录酶与DNA聚合酶在同一管内同样缓冲液条件下完成反应。一步法RT-qPCR只需要利用序列特异性引物。在两步法RT-qPCR中，逆转录和PCR扩增过程是在两个管中完成，使用不同的优化的缓冲液、反应条件、以及引物设计策略。

在设计RT-qPCR实验过程中，决定是否要使用总RNA或纯化的mRNA作为模板进行逆转录十分重要。尽管mRNA可能能够提供略高的灵敏度，但总RNA仍经常使用。其原因是总RNA作为起始材料具有较mRNA更重要的优势。首先，其过程需要较少的纯化步骤，这确保了更好的定量回收模板和更好的把结果标准化为起始的细胞数。其次，其避免了mRNA富集步骤，这能够避免由于不同mRNA的回收率不同而带来的结果偏移的可能性。总的来说，由于在大多数的应用中，目标基因的相对定量比检测的绝对灵敏度更为重要，因此在大多数情况下，总RNA更适用1。

在两步法中，有三种不同的方法可用于引发cDNA反应：oligo(dT) 引物、随机引物、或序列特异性引物（图2，表2）。通常情况下，是将 oligo(dT) 引物和随机引物进行混合使用。这些引物退火至模板 mRNA 链，并提供给逆转录酶一个用于合成的起点位置。

逆转录酶是利用 RNA 合成 DNA 的一种酶。一部分逆转录酶具有 RNA 酶活性，能够在转录后降解 RNA-DNA 杂交链中的 RNA 链。如果其不具有 Rnase 酶活性，可加入 RNaseH 以获得更高的 qPCR 效率。常用的酶包括莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶（MMLV）和禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶（AMV）。对于 RT-qPCR 来说，理想的情况下是选择具有较高热稳定性的逆转录酶，这样 cDNA 的合成能够在较高的温度下进行，确保成功转录具有较高二级结构的 RNA，同时保持其在整个反应过程中的全部活性，从而得到更高的 cDNA 产量。

RNase H 能够从 RNA-DNA 双链中降解 RNA 链，从而允许双链 DNA 的有效合成。然而，当使用长 mRNA 作为模板，RNA 可能被过早的降解，从而导致截短的 cDNA。因此，在 cDNA 克隆过程中，如果需要合成长的转录物时，尽量减小 RNase H 的活性通常是有益的。与此相反，拥有 RNase H 活性的逆转录酶通常有利于 qPCR 的应用，因为它们能够在 PCR 的第一个循环中提高 RNA-DNA 双链的熔解（图3）。

用于 RT-qPCR 中 qPCR 步骤的 PCR 引物最好应设计成跨越一个外显子-外显子连接，其中一条扩增引物可以潜在地跨越实际外显子-内含子边界（图4）。由于含内含子的基因组 DNA 序列不会被扩增，因此这种设计可以减少从污染的基因组DNA中扩增得到的假阳性的风险。

如果引物不能被设计成能够分离外显子或外显子-外显子边界，则有必要利用无 RNA 酶的 DNA 酶I或 dsDNA 酶处理 RNA 样品以除去基因组 DNA 污染。

一个逆转录阴性对照（-RT对照）应该包括在所有的 RT-qPCR 的实验中，以检测 DNA 污染（如基因组 DNA 或来自之前反应的 PCR 产物）。这一对照包含除逆转录酶之外的所有反应组分。由于该对照不会发生逆转录，因此如果观察到 PCR 扩增，则极有可能来自 DNA 的污染。

做qPCR时内参引物所需温度与目的基因相差5度左右，可以一起做

一般来讲，进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液，只需要加入模板和引物就可以。由于real-time qPCR灵敏度高，所以每个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中，由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析。通常来讲，反应体系的引 物终浓度为100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500，如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液，要根据目的基因 的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值，在 *** 作过程中，还需要根据所用MasterMix，模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系。在反应体 系配置过程中，有下面几点需要注意：

1 MasterMix不要反复冻融，如果经常使用，最好溶解后放在4度。

2 更多的配制Mix进行，减少加样误差。最好能在冰上 *** 作。

3 每管或每孔都要换新q头！不要连续用同一个q头加样！

4 所有成分加完后，离心去除气泡。

5 每个样品至少3个平行孔。

参比或者校正染料（reference dye，passive dye）常用的是ROXTM（现在已经是ABI的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。参比染料的作用是标准化荧光定量 反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差，提供一个稳定的基线。现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者 Premixture里。如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正。

U6是一类核小分子RNA，由RNA聚合酶III启动。

做miRNART-PCR有茎环法和加尾法，U6很常用，你自己查相关的文献就能看到别人现成设计好的。加尾法的反向引物的通用的，正向引物就拿U6的序列，自己设计就行。

序列在下面：

Tomato U6 small nuclear RNA gene

1 ataaatcttt ttaatttata gtatatttat gtaagttttc acgttgagta aatagcgaag

61 aagttgggcc caaccaagta aaataagaag gccgggccat tacaattaag tcgtcacaca

121 actgggcttc attgaaaaaa gcgcaaaacc gattccaggc ccgtgttagc atgaagactc

181 aactcaacca gagatttctc cctcatcgct tacagaaaaa agctatatgc tgtttatatt

241 gcgaatctaa cagtgtagtt tgtcccttcg gggacatccg ataaaattgg aacgatacag

301 agaagattag catggcccct gcgcaaggat gacacgcaca aatcgagaaa tggtccaaaa

361 ttttttttgc cattcttttc aagctccatt gtcaaatttt cggggggttt tgaagtcgcc

421 tatctgaggt tagtctctct gcatctgatc agtctgaaac tttagtcgct gagcttattc

481 tttgttctgg acttgaagat taggtcaaat gattaggttt atctttcaat tatatagta

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对同一种样本，针对不同基因采用不同的引物进行qPCR，对于每一个样本还得设置一个内参对照。用每个基因复孔CT值的平均值减去内参的平均值求的δCT，再比较各组基因的表达差异。

也可以绝对定量，将稀释的标准品和待测样品同时进行qpcr，通过Ct值根据标准曲线求绝对表达量。

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