如何用流式检测细胞凋亡

前言

细胞凋亡通常称为细胞程序性死亡，是由基因控制的主动性细胞死亡过程。越来越多数据发现，细胞凋亡与多种疾病密切相关，如癌细胞具有连续增殖、抵抗细胞凋亡能力，利用流式细胞仪分析细胞凋亡可为肿瘤诊断，疗效评价和预后预测提供了重要的参考指标。然而很多实验的同学们，常会碰到上机检测时细胞死亡太多却检测不出凋亡，多次重复结果不一致等现象，本文就一起看看如何把细胞凋亡的数据变的更加漂亮，准确！

首先，明确一下细胞凋亡和坏死的区别

细胞凋亡(apoptosis) 是一件主动性细胞死亡事件，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控，是细胞为更好地适应环境而主动争取的一种死亡过程。 具体表现为： 出芽形成凋亡小体、核小体间DNA的切割，凋亡小体被吞噬和消化等几个连续过程等[1]（如下图所示）。

图1：细胞凋亡的发生过程[1]

细胞坏死（necrosis） 则是一件被动的过程，是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程，即病理条件下，自体损伤的一种现象。 具体表现为： 细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，会引起局部严重的炎症反应（如下图所示）。

图2：细胞坏死的发生过程[1]

一、流式检测细胞凋亡的原理

Annexin V和PI双染法是流式检测细胞凋亡的经典方法 ，它是基于凋亡的早期细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine, PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面这一原理来实现的（如下图3）。

图3：凋亡早期 PS从细胞膜的内侧外翻

该方法简便、快速、准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞，具体原理如下：

因此，将Annexin V与PI联合使用时，便可用来鉴别活细胞，凋亡细胞及死亡细胞。

二、实验 *** 作步骤

三、数据分析

Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒是用FITC标记的Annexin V作为探针，FITC最大激发波长为488 nm，最大发射波长525 nm，FITC的绿色荧光在FL1通道检测；PI-DNA复合物的最大激发波长为535 nm，最大发射波长为615 nm，PI的红色荧光在FL2或FL3通道检测。通过软件分析，绘制双色散点图，FITC为横坐标，PI为纵坐标。

如下图所示：细胞可以分为4个象限：

图4：4个象限的细胞分布图

举例：如常用于研究药物或者基因等对细胞凋亡的影响。 通过比较Control组和药物组，发现化合物可以诱导前列腺癌细胞系PC-3M的细胞凋亡，处理组（20μM）的晚期凋亡细胞比例与Control组（0μM）相比，从1.79%上升到11.39%。进而还可根据每个象限的数据计算出活细胞、凋亡细胞和坏死细胞百分率。

图5. 药物浓度梯度依赖性的诱导PC-3M细胞凋亡[2]

四、常见问题解答

1. 如何避免出现假阳性结果？

2. 为什么必须收集细胞上清？

因为凋亡的细胞可能会脱壁，悬浮于培养基，所以必须收集上清再离心取沉淀，合并胰酶消化下来的细胞，不然检测出来的凋亡比例可能会减少。

3. 为什么在染色后1h内就要上机检测？

由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后1小时之内进行分析；PI受时间的影响很大，因标记了PI后会加大细胞毒性，特别是检测早期凋亡时，如果时间延长除了会导致在流式细胞仪上的细胞分群差距加大外，误差会明显加大，所以建议在一个小时内检测。

4. 其他注意事项

参考文献：

[1]Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol 200735:495-516.

[2]Qin M, Peng S, Liu N, et al. LG308, a Novel Synthetic Compound with Antimicrotubule Activity in Prostate Cancer Cells, Exerts Effective Antitumor Activity.[J]. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 2015,355(3): 473-483.

目前临床实验室做白细胞流式一般所采用的标准程序是：

第一种：先染色，然后裂解红细胞，再洗涤，然后固定，上机

第二种：先裂解，然后染色，再洗涤，固定，上机。

一般是不分离白细胞的，因为一是要多耗费离心的时间，第二容易损失细胞。

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