脉动真空压力蒸汽灭菌器为什么第三方检测

首先这个是保证产品的质量合格，同时也是保证消费者的权益：

影响脉动真空压力蒸汽灭菌器灭菌效果的因素，找出原因及时纠正保证灭菌质量。

方法 通过日常灭菌，每锅用标准监测包外贴化学指示胶带，包内放置化学指示卡、留点温度计和生物指示剂。对2160锅10800例进行试验观察。

结果 化学指示胶带全部合格，化学指示卡15例变色不均匀，36例灭菌包潮湿，生物监测1例不合格。

结论 严格按照 *** 作程序和装放要求，正确使用化学指示剂是确保灭菌效果的关键。

材料与方法

11 材料

化学指示胶带、指示卡、B-D指示图纸、生物指示剂。嗜热脂肪杆菌芽胞菌片含菌量为50×105～50×106CFU/片，标准监测包体积为30cm×30cm×25cm。

12 方法

121 B-D试验

灭菌器在每日使用前冷锅将B-D指示图纸置于试验包的中央，将试验包平放于灭菌器底部靠近柜门与排气口附近，抽3次真空，经132℃～134℃灭菌35～4min干燥、排空、打开锅门,取出B-D试纸观察变色是否均匀。

122 实验方法

将化学指示卡、留点温度计、生物指示剂置于标准监测包的中心部位，外贴化学指示胶带，置于灭菌器中温度难以达到之处,每锅放置5个点(上层中部、中层右前左后、下层右后和排汽口20cm处)。经过一个灭菌周期，打开锅门，取出标准监测包，检查化学指示胶带、指示卡变色是否均匀，留点温度计所表示的温度是否符合要求，嗜热脂肪杆菌芽胞菌片，在无菌 *** 作下从袋中取出并移种菌片溴甲酚紫蛋白胨培养液中;自含式指示剂取出后，将盖朝上垂直于手中，用夹子夹住菌管下部，压碎安瓿，使培养基与菌片混合在一起，置于56℃恒温箱内培养48h。同时接种阴性和阳性对照,观察结果。结果判断培养管内培养基不变色为无菌生长，培养基由紫色变为**时则灭菌失败，灭菌处理后菌片和阴性对照培养全部无菌生长，阳性对照有菌生长，即可判定为灭菌合格。

2 结果

经2160次监测10800例，化学指示胶带全部合格，化学指示卡15例变色不均匀，36例灭菌包潮湿，B-D试验有2次变色不均匀，生物监测1例不合格。

以上是脉动真空压力蒸汽灭菌器检测的相关信息，由百检信息科技有限公司整理，希望帮助到你，望采纳

在自然界里，食用菌都不是单独存在的，而是和许多细菌、放射菌、霉菌等生活在一起的。所谓菌种分离，就是把这些和食用菌一起生活的杂菌分离出来，通过培养，获得纯的优良菌种。菌种分母种、原种、栽培种。 \x0d\(一）母种的分离培养 \x0d\\x0d\食用菌母种的分离，可分为孢子分离法、组织分离法以及基内菌丝分离等。 \x0d\1孢子分离法 \x0d\孢子分离法，是用食用菌的有性孢子或无性孢子萌发成菌丝，培养成菌种的方法。这种菌种生活力较强，但孢子个体之间有差异，且自然分化现象较严重，变异大，需经出菇试验才能在生产上应用。 \x0d\（l）单孢分离法：是每次或每支试管只取一个担孢子， 让它萌发成菌丝体来获得纯菌种的方法。蘑菇和草菇用单孢分离得到的菌丝，有结实能力，可采用此法分离生产纯菌种。单孢分离生产上较少采用，而且技术复杂，一般采用多孢分离法。 \x0d\（2）多孢分离法：就是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法。具体 *** 作方法，有以下几种： \x0d\①种菇孢子d射法：选择个体健壮、朵形圆正，无病虫害、出菇均匀、高产稳产，适应性强的八九分成熟的种菇，切去大部分，菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分。在接种箱或无菌室内，把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面，漏斗倒盖在培养皿上面；上端小孔用棉花塞住。培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上，静置12～20小时，菌褶上的孢子就会散落在培养皿内。形成一层粉末状孢子印（平菇极淡紫色，蘑菇、草菇 为褐色，香菇、金针菇孢子印白色）。用接种针沾取少量孢子在试管中的琼脂外面或培养皿上划线接种。待孢子萌发，生成菌落时，选孢子萌发早、长势好的菌落进行试管培养。 \x0d\还可用孢子采集器收集孢子。方法是选好种菇后，按上述程序，轻轻掀开玻璃钟罩，将种菇柄朝下插在孢子采收器的钢丝架上，放在培养皿正中央。随即盖好玻璃罩，用纱布将钟掌周围塞好。并在纱布上倒少许升汞或无菌水。移入 20℃左右恒温箱培养。 \x0d\②褶上涂抹法：按无菌 *** 作分离时；应选择成熟的种菇，用接种针直接插入褶片之间，轻轻抹取褶片表面子实体尚未d射的孢子，再在培养基上划线接种。 \x0d\③钩悬法：取成熟菌盖的几片菌褶或一小块耳片（黑木耳、毛木耳、白木耳〕，用无菌不锈钢丝（或铁丝、棉线等其他悬挂材料）悬挂于三角瓶内的培养基的上方，勿使接触到培养基或四周瓶壁。置适宜温度下培养、转接即可。 \x0d\④贴附法：按无菌 *** 作将成熟的菌褶或耳片取一小块， 用溶化的琼脂培养基或阿拉伯胶、浆糊等贴附在配管斜面培养基正上方的试管壁上。经6～12小时的培养，待孢子落在斜面上，立即把孢子连同部分琼脂培养基移植到新的试管中培养即可。 \x0d\孢子分离得到的母种、必须进一步提纯复壮，当母种定植一星期左右，菌丝布满斜面时，选择菌丝健壮、生长旺盛无老化、无感染杂茵的母种试管，进而转管扩大，一般到栽培种，转管不宜超过5次。 \x0d\孢子分离得到的母种，必须通过出菇试验，鉴定为优质菌种后，才可供生产使用。 \x0d\一般菌类如蘑菇、平菇、凤尾菇、香菇、冬菇和草菇等，都可用多孢分离法获得母种。 \x0d\现就银耳孢子分离略述于下： \x0d\按无菌 *** 作获取种耳后，悬挂种耳的三角瓶经12小时培养后，瓶底培养基表面就有"孢子印"。取出种耳，置 20℃—25℃温箱培养2～3天，培养基表面会出现乳白色透明的糊状小菌落，就是银耳的酵母状分生孢子形成的少量银耳菌丝。此时移接入试管斜面培养基上，待长满斜面后，再移接入营养丰富，且表面比较干燥的培养基上。经30天左右，菌落长出白色菌丝。 \x0d\银耳的酵母状分生孢子、菌丝只有与羽毛状菌丝的子囊菌（香灰菌丝）混合培养时，由后者帮助分解木材及其他一些纤维物质，提供营养，才能利于银耳孢子萌发，菌丝的定植和子实体的形成。 \x0d\在两种菌丝交会时，先选出两种纯菌丝。 \x0d\羽毛状菌丝要纯化选育，一般要选取生长迅速，爬壁力强的试管斜面或种瓶，取先端菌丝，转管移接，置25℃—28℃上培养，重复转管几次即可得到优良纯种。 \x0d\银耳菌丝的特点，菌丝生长缓慢，担孢子也不易萌发。在进行两菌混合时，先取经8～IO天培养的银耳菌丝斜面，按无菌 *** 作方法在该斜面上距银耳菌丝约05厘米处接入一 小块羽毛状菌丝。置25℃下培养1周即得到混合好的银耳母种。 \x0d\2．组织分离培养法 \x0d\利用子实体内部组织，进行无性繁殖而获得母种的简便方法，即组织分离。该法 *** 作简便，菌丝生长发育快，品种特性易保存下来，特别是杂交育种后，优良菌株用组织分离法能使遗传特性稳定下来。常采用以下分离方法。 \x0d\（l）子实体分离：种菇要选朵大盖厚，柄短，八九分成熟的优良品种。切去菇两基部，在无菌箱内以01％的升汞水浸几分钟，再用无菌水冲洗并揩干或用75％酒精棉球擦拭菌盖与菌柄2次，进行表面消毒。接种时，只要将种菇撕开，在萌盖和菌柄交界处或菌褶处，挑取一小块组织；移接 到PDA培养基上。置25℃左右温度下培养3-5天，就可以看到组织上产生白色绒毛状菌丝，转管扩大即得到菌种。如香菇、平菇等可以用此方法。 \x0d\（2）菌核分离：茯苓、猪苓、雷丸等菌的子实体不易采集。而常见的是它贮藏营养的菌核。用菌核分离，同样可以获得菌种。方法是将菌核表面洗净，用酒精或升汞消毒后，切开菌核，取中间组织一小块，约黄豆大小，接种在PDA 培养基斜面上，保温培养。应注意的是，菌核是贮藏器官，大部分是多糖类物质，只含有少量的菌丝，因此挑取的组织块要大一些，如果组织块过小，则不易分出菌种。 \x0d\（3）菌素分离：有一部分子实体不易找到，也没有菌核，可以用菌素进行分离。如蜜环菌、假蜜环菌。其 *** 作方法是先用酒精或升汞将菌素表面黑色皮层轻轻擦拭2～3次， 然后去掉黑色外皮层（菌鞘），抽出白色菌髓部分；用无菌剪刀将菌髓剪一小段，接种在培养基上，保温培养，即得该菌菌种。 \x0d\菌素分离要注意：因菌素比较细小，分离素也比较细小，分离时极易污染杂菌，所以要严格 *** 作。 \x0d\3．基内菌丝分离培养法 \x0d\利用食用菌生育的基质作为分离材料，来得到纯菌种的一种方法，叫基内菌丝分离法。 \x0d\此种分离方法是适宜只有在特定的季节才出现，而且是朝生暮死，不易采得的子实体。基内分离法与组织分离法不同之点是，干燥的菇木或耳木中的菌丝常呈休眠状态。接种后有时并不立刻恢复生长。因此，有必要保留较长的时间（约1个月），以断定菌丝是否能成活。基内菌丝分离法又可分为，材中菌丝分离（即菇木或耳木分离法）及土中菌丝分离法等。 \x0d\（1）材中菌丝分离法：就是菇木或耳木分离法，为了减少杂菌的感染，菇（耳）木在分离之前，必须进行无菌处理。可以把菇（耳）水表面用酒精灯火焰轻轻烧过，以烧死霉菌的孢子，或再用01％的升汞水浸孢几分钟，然后用无菌水冲洗后用无菌滤纸吸干。接种块切取时应注意。接种块必须在该菌菌丝分布的范围内切取。所以，菌丝生长缓慢的种类应浅取；菌种生长快的种类可以深取。同时。还应根据菇菌的种类、木材质地、菇（耳）木粗细、发育时间的长短来确定菌丝分布的范围。然后用一把利刀进行切取。接种块应尽量小些，以减少杂菌感染机会，提离菌种的纯度。接种块移到培养基上，就应该放到适合菌丝生长的22℃～26℃ 的温室或温箱中培养，使菌丝恢复生长。 \x0d\（2）土中菌丝分离：食用菌种类很多，许多土生的食用菌；孢子不易萌发。组织分离也不易成功，用土中菌丝分离获得纯种的方法，叫土中菌丝分离。 \x0d\土中菌丝分离时要注意，由于土中菌丝体的周围生活着多种多样的土壤微生物，因此分离时必须尽可能避开这些微生物的干扰，尽可能批取清洁菌丝素的尖端、不带杂物的菌丝接种，反复用无菌水冲洗，在培养基中加入一些抑制细菌 生长的药物，如 40微克／升的链霉素或金霉素。如发现感染细菌，可以把菌落边缘的菌丝挑出来，接种到木屑培养基中。因细菌没有分解木质素的能力，因此在木屑培养基中不易扩展；只局限于接种处。待菌丝长出感染区后，就可以再进行扩大提纯了。 \x0d\（3）子实体基部分离：从瓶栽、袋栽或大床栽培的子实体基部分离出新菌丝的方法，叫子实体基部分离，现以袋栽银耳为例说明： \x0d\从出耳早、出耳率离、无病虫害的栽培室中；选择生活力最强的幼耳5袋，移到气候温和，有散射光的野外场所进行后期培养，以增强菌丝体的生活力。经培养7～10天后，待子实体直径达4～5厘米时便可取回，作为分离的母体。再从中筛选最理想的一朵，用利刀割掉银耳子实体，放置于 0℃的冰箱或有敌敌畏的容器中过夜，以便杀死瓶中的害虫。然后用75％酒精或升汞擦洗耳基和袋子外边的杂质，连同接种工具、接种培养基等移进无菌室。经灭菌后，用接种刀把袋口上部约15毫米厚的老菌根挖除，并进行培养。待袋口露出白色菌丝时，用接种针挑取一块半粒米大的白色菌结体，迅速移入母种试管培养基的中央，轻轻地脱去接种针， 塞上棉塞。 为了能够获得较多的母种，一次接种量要有100—200支试管，以便从中选择。分离后应及时移入22℃—24℃恒温箱或温室中培养。由于培养基内水分较多，菌丝恢复要比耳木分离得快。经2-3天后，分离物的边缘就可看 到白色菌丝。每天要至少观察两次，以便提纯。观察、提纯方法与耳木分离法担同。经适温培养10-15天后，当接种块扭结团出现红、**水珠时，即可扩大原种。 \x0d\\x0d\（二）原种和栽培种的接种培养 \x0d\\x0d\母种获得以后，为了满足菌种生产的需要。应选出优良、纯度高的母种进一步扩大为原种。 \x0d\原种培养基一般采用棉籽壳、木屑、草类等培养基。 \x0d\瓶装或袋装的原种培养基灭菌后，可送入灭过菌的接种箱内，待瓶中的培养基冷至30℃以下，可按照无菌 *** 作程序进行接种。 \x0d\菌种瓶（袋）放入培养室时，要经常进行检查，一经发现杂菌污染，立即取出。培养成的原种，菌丝体必须健壮有力，紧贴瓶壁而不干缩，颜色纯正，具有一定清香味，生活力强，扩制成栽培种时吃料快。 \x0d\栽培种就是将原种进一步扩大培养成三级种，它和原种的接种及培养相同。一般香菇、平菇、冬菇、猴头、木耳、银耳的栽培种多用锯木、棉皮作培养基。蘑菇多用粪草做培养料。 \x0d\栽培种要求料块不脱水干缩。菌丝体健壮有力、颜色纯正，有清香味，无老化现象，无杂菌污染，有的种许可有少量原基，接入栽培料后，发菌快，长势好，生活力强。 \x0d\原种在接栽培种时，原种瓶口的一层菌丝体应挖去不用。 \x0d\\x0d\（三）液体种的简单培养 \x0d\\x0d\目前，用液体深层发酵法生产菌种，具有生产量大、周期短、菌龄整齐、成本低廉、接种方便等特点，是实现食用菌工厂化生产的目标。现将液体种培育过程简述于后，供参考。 \x0d\简言之就是将纯正优良的菌种，接入液体培养基（固体培养基不加凝固剂），使菌丝繁殖形成大量小菌球，然后将这种培养基拌入木屑或棉籽皮料内，制成菌块、培养其形成子实体。还可用于制原种、栽培种。 \x0d\培养液体菌种，可将培养液装入三角瓶中，约占空瓶的五分之一重量。用摇瓶机（也称摇床）来培养。摇瓶机有旋转式和往复式两种，一般多用往复式。液体培养基可用马铃薯汁（加糖），麦芽汁配制，也可用玉米粉、豆饼粉、糖、无机盐等配制。可以混合培养基，因适用于多种食用菌和药用菌的培养，均有好效果。组分：豆饼粉2％，玉米粉1％， 葡萄糖3％，酵母粉05％，磷酸二氢钾01％，碳酸钙 02％， pH自然， 12℃灭菌半小时。然后接种培养。 \x0d\如果生产量较大，在三角瓶的基础上，再逐级扩大种子缸，发酵罐中进行液体深层通气发酵，产生大量菌种。但由于生产中要求设备繁多，技术性强，我们还应创造条件；实现食用菌栽培的现代化。 \x0d\\x0d\（四）菌种质量的鉴定 \x0d\\x0d\菌种质量鉴定最好的方法是，做出菇试验。但是时间比较长。在购置菌种时，或在菌种生产中，如何能知菌丝生长情况，快速判断菌种质量？我们介绍几种方法： \x0d\1肉眼观察：优良菌种菌丝浓白，绒状，粗壮密集，生长整齐，速度快，香味浓厚。 \x0d\2优良菌种标准可归纳为："纯、香、正、壮、润"五个字。检查时，打开瓶塞，从菌种瓶中部取出小块菌丝体，观察色泽，闻其气味，手捏料块检查其含水量，看是否符合上述要求标准。 \x0d\3显微镜检查：挑取少量菌丝，置显微镜上观察其形态，菌丝分枝，分隔情况，锁状联合，细胞膜的厚薄。 培养观察：从菌种瓶中挑取小块菌丝体，接种斜面试管培养基上，置23℃～25℃恒温中培养，经五周后检查菌种生活力。如果菌丝生长快，旺盛纯一，健壮浓厚，长且整齐，则表示菌种的生活力强。 \x0d\4分块法：在桌上放一张白纸，把菌龄相同的菌种从瓶内取出一大块，用手分成2块，再把2块分成4块，4块 分成8块，依次进行。优良菌种整块多，碎渣少。劣次菌整块少，碎渣多。 \x0d\5液体菌种鉴别：当三角瓶或发酵缸培养3-7天后，如液面出现气泡，产生"油皮"、混浊等现象，说明菌种本 身带有杂菌。如菌块上浮，或迟迟长出很薄的菌丝层，则说明菌种生活力弱。白块四周的菌丝生长快、浓白、棉絮状，表明菌种生命力强。 \x0d\\x0d\（五）菌种生产过程中的杂茵防治 \x0d\\x0d\在生产菌种时，要时刻注意杂菌污染，以防为主，一旦发生，根治很不容易。所以整个制种过程都必须在无菌条件下进行。接种箱及所有分离、接种的用具、器皿，都要进行严格的消毒灭菌。工作人员的双手要用消毒剂清洗，并穿戴消过毒的工作服、帽和口罩，动作要敏捷、准确，尽量不要讲话走动，以防空气中的杂菌感染。 \x0d\分离母种时，选择出菇早、生活力强，第一潮菇是关键，因它生活力强，接种后迅速占领阵地，无杂菌侵入的机会。 \x0d\被污染的菌种，原因是多方面的，一般是灭菌不彻底所致，或因接种时无菌 *** 作不严、瓶盖不合适造成的。所以灭菌一定要彻底，最好在接种萌将培养基置25℃左右温箱中做效果检查，经2天不长杂菌，说明彻底，可以使用，接种过程中一定要严格无菌 *** 作。 \x0d\污染杂菌另一个原因可能是分离母种时感染杂菌，因种菇表面带菌，消毒不彻底，通过组织块将杂菌带入培养基。 \x0d\总之，污染机会很多，要注意环境消毒，按无菌 *** 作规程彻底灭菌，层层把关，环环抓紧，严加注意；提离菌种质量。

结核杆菌与麻风杆菌是分枝杆菌属中的主要病原菌。

结核杆菌菌体细长略带弯曲，有分枝生长趋势。菌体含脂量高，与其抗酸特性、抵抗力特性、致病性与免疫性等都有密切关系。该菌营养要求高，生长缓慢，形成“菜花状”菌落。

一、结核杆菌检验程序

结核病人病灶中查到结核杆菌，是病原学诊断的重要依据，根据感染部位不同，可采集病人的痰、尿、粪便、脑脊液、胸腹水、胃液等，按以下程序进行检验。

二、结核杆菌培养特性

1 液体培养基（苏通氏培养基、小川培养基、血清酸性培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理（即酸碱处理，可液化标本，也可杀死杂菌，还可浓缩集菌）后接种液体培养基，35℃培养1-2周，由于表面生物，可在培养基表面表成污灰、干燥、有皱褶的菌膜。

2 固体培养基（改良罗氏培养基、丙酮酸钠培养基等）结核杆菌生长表现：标本材料经前处理后，接种固体培养基，37℃培养2-4周，在培养基表面可形成乳白或米**、不透明、粗糙颗粒状或节状堆聚的菌落，呈现“菜花状”。

3 结核杆菌快速培养检测方法：无菌手续将前处理后的材料涂片，置液体培养基中，35℃恒温箱CO2培养箱内培养，3-5日后，每隔日取出一玻片，染色镜检，可快速获得结果。

三、齐~尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法

原理

结核杆菌对苯胺染料不易着色，若加温或延长染色时间使其着色后，再用3%盐酸酒精处理也不易脱色，再经美兰复染，结核杆菌及其他分枝杆菌仍呈红色，而非抗酸菌和细胞杂质等呈蓝色。

材料

1 结核病人痰液：采取清晨第一口粘痰，或浓缩集落菌法处理过的痰标本。

2 抗酸染色液

3 载物玻片、玻片夹、酒精灯、腊笔等。

方法

1 无菌手续采取痰液涂片，自然干燥，火焰固定。

2 用腊笔将涂面局部隔开，滴加石炭酸复红染液，酒精灯上加热至出现蒸气。切勿沸腾，亦不可使染液干涸。如有干涸的趋势，应及时补加染液。持续染色5-8分钟，待冷后流水漂去多余的染液。

3 用3%盐酸酒精清脱色，脱至涂面无色为止，约1-3分钟，自来水冲洗。

4 滴加吕氏美兰染液复杂30秒~1分钟，水洗。自然干燥或吸干后油镜检查。

结果

1 结核杆菌呈现细长，略有弯曲的红色菌体，有的可表现出分枝特征，有的菌体表现有多数浓染颗粒。结核杆菌大多分散排列，亦可以见到有纵行条索状排列。

2 涂片染色能查到结核杆菌者，一般需要每毫升痰液内含菌量至少应有500个以上，甚至需达到5万以上。故材料多进行浓缩集菌处理，以提高检出阳性率，也造成在染色标本片观察中，不一定每个视野都能看到结核杆菌。

3 结核杆菌易发生变异，在陈旧培养基或临床治疗后标本材料中，结核杆菌往往菌体断裂，或形成非抗酸性革兰氏阳性的短杆状、球状颗粒，亦称Much颗粒。

4 标本已经高压灭菌处理，不影响染色结果，也保证 *** 作者的安全。

四、荧光染色法

此系用金胺荧光素染扩酸性细菌的方法，简便易行，但不具特异性。金胺染色法有多种、现列于后表，可选择使用，应用荧光显微镜检查结果。

五、结核杆菌毒力试验——动物试验法

材料

1 动物：体重200~250克豚鼠2只

2 结核杆菌培养物或结核病人检验材料（痰、尿、粪、腹水等材料经浓缩集菌）

3 注射器及消毒用材料等。

方法

1 选取结核菌素试验为阴性的豚鼠两只。

2 吸取结核杆菌悬液或病人检材，注入豚鼠腹股沟皮下01ml

3 注射后每周定期检查一次，观察豚鼠腹股沟淋巴结是否肿大，局部变硬，化脓及体重减轻、体温升高等症状。

4 给豚鼠作结核菌素试验，是否出现阳性结果。

5 6周后，将豚鼠进行解剖，观察淋巴结是否肿大，有无干酪性病变，肝、脾、肺等是否肿大，表面有无灰白色结节病灶，取可疑病灶进行涂片染色镜检和分离培养。若为阳性结果，可报告“动物接种后××天查到有结核菌感染”。如无症状及病变者，可报告为阴性。

六、结核杆菌浓缩集菌法（以处理痰标本为例）

材料

结核病人24小时痰液，细口瓶，002%酚红液、汽油，NaOH，无菌生理盐水等。

方法

(一)漂浮法：

1 取24小时痰液15毫升，装入细口瓶内，加入2倍量05%NaOH摇匀，高压灭菌或煮沸20—30分钟杀菌。

2 待冷后加入汽油2毫升（二甲苯也可以），用力振荡20—30分钟，用生理盐水加至液面与瓶口齐，静置半小时。

3 取瓶口表面油状物涂于载物玻片上，微微加热，干后再加，如此重复5—6次，至厚度适宜，烘干待冷，抗酸染色，油镜头检查。

(二)沉淀法：

1 取痰液1份或2倍量4%NaOH，高压无菌或煮沸20—30分钟后，加入002%酚红指示剂01毫升，剧烈振荡混匀，亦可置37℃水浴消化30分钟。

2 矫正PH为70，3000转/分离心30分钟，弃去上清液。

3 取沉淀物涂片染色镜检。若进行分离培养和动物接种，可免去高压灭菌或煮沸的程序。

附录：抗酸染液的配制

1 石炭酸复红液：称取碱性复红4克，溶于95%酒精100毫升中成饱和液。再取饱和液10毫升与5%石炭酸溶液90毫升混匀即成。

2 3%盐酸酒精：取浓盐酸3毫升，95%酒 97毫升混合。

3 吕弗勒氏碱性美兰液：称取美兰2克，溶于95%酒精100毫升中，配成饱和液，取饱和液30毫升，再加入蒸馏水100毫升及10%氢氧化钾水溶液01毫升即成。

人胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）试剂盒（ELISA）

使用说明书

l 本试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中人胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）的含量。

l 有效期：6个月

l 保存条件：2-8℃

l 本试剂盒仅供体外研究使用，不用于临床诊断

实验原理

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的**。颜色的深浅和样品中的人胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。

样本处理及要求

1  血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2  血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2 - 8°C 1000g离心20分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3  组织匀浆：用预冷的PBS (001M, pH=74)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4  细胞培养物上清或其它生物标本：1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

标本处理

1  本公司只对试剂盒本身负责，不对因使用该试剂盒所造成的样本消耗负责，请使用者使用前充分考虑到样本的可能使用量，预留充足的样本。

2  实验前应预测标本含量，如果标本浓度过高，应对标本进行稀释，使稀释后的标本符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。标本使用001mol/L的PBS稀释(PH=70-72)。

3  若所检样本不包含在说明书所列样本之中，建议进行预实验验证其有效性，并注意留存样本。

4  使用化学裂解液制备的组织匀浆或细胞提取液可能会由于某些化学物质的引入导致ELISA实验结果偏差。

5  若样本为细胞培养上清，因该类样本干扰因素较多，如：细胞状态、细胞数量、采样时间等，所以可能存在检测不出的情况。

6  某些天然蛋白或重组蛋白，包括原核及真核重组蛋白，可能因为与本产品所使用的检测抗体及捕获抗体不匹配，而不被检测出。

7  建议使用新鲜样本，保存时间过长可能会存在蛋白降解或变性导致实验结果偏差。

需要而未提供的试剂和器材

1 酶标仪（450nm）

2 高精度加样器及q头：05-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3 37℃恒温箱

4 蒸馏水或去离子水

备注：

1  标准品浓度依次为：200、100、50、25、125、0 ng/mL

2  经过大量正常标本检验，标本的正常浓度值均在试剂盒提供的检测范围内，实验过程中直接取50μL样本上样即可。当有部分样本值超过最大标准品浓度时，可用样本稀释液将标本进行适当稀释后再进行实验。

注意事项

1 严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2 洗板不正确可以导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

3 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。

4 底物显色液应呈无色或很浅的颜色，已经变蓝的底物液不能使用。

5 避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6 在储存和温育时避免强光直接照射。

7 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。

8 任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

9 不能使用过期产品。

10 如果可能传播疾病，所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。

试剂准备

试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡后方可使用。

20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份20×洗涤缓冲液加19份蒸馏水。

*** 作步骤

1  从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2  设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3  样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。

4  除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5  弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7  每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

实验结果计算

以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。

试剂盒性能

1  检测范围：625 ng/mL – 200 ng/mL。

2  灵敏度：最低检测浓度小于10 ng/mL。

3  特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。

4  重复性：板内变异系数小于10% ，板间变异系数小于15% 。

说明

1  由于现有条件及科学技术水平尚不能对所有供货商提供的所有原料进行全面的鉴定与分析，本产品可能存在一定的质量技术风险。

2  最终的实验结果与试剂的有效性、实验者的相关 *** 作以及当时的实验环境密切相关，请务必准备充足的标本备份。

3  不同批次的同一产品可能会有少许差别，如：检测限、灵敏度以及显色时间等，请依据试剂盒内说明书进行实验 *** 作，网站电子版说明书仅作参考。

4  只有全部使用本试剂盒配套试剂才能保证检测效果，不能混用其他制造商的产品。只有严格遵守本试剂盒的实验说明才会得到最佳的检测结果。

问题解答

若实验效果不好，请及时对显色结果拍照，保留所用板条及未使用试剂，并妥善保存，然后联系我公司技术支持为您解决问题。同时您也可以参考以下资料：

 BIM试剂盒为您提供！

目录 1 拼音 2 英文参考 3 器材 4 试剂 5 材料 6 每个实验小组的用量 61 器材 62 试剂 63 材料 7 石蜡切片法实例（一） 71 目的要求 72 实验原理 73 实验用品 74 实验程序 8 石蜡切片法实例（二） 81 目的要求 82 实验原理 83 实验用品 84 实验程序 1 拼音

shí là qiē piàn

2 英文参考

paraffin section

3 器材

切片刀，切片机，恒温箱，温台，熔蜡炉，蜡杯，酒精灯，蜡铲，展片台，解剖刀，解剖针，解剖剪，解剖盘，培养皿，吸管，镊子，单面刀片，台木，毛笔，洒精灯，包埋纸盒，染色缸，盖玻片，载玻片，玻片盘，树胶，树胶瓶，显微镜，温度计，脸盆，水浴锅。

4 试剂

卡诺氏固定液、FAA固定液、各种浓度的酒精、二甲苯、石蜡、蜂蜡、埃利希苏木精染液， 1%伊红酒精溶液，1%盐酸酒精溶液，甘油蛋白粘片剂，郝普特氏粘片剂，中性树胶。1%番红，1%固绿，1%过碘酸，Schiff试剂，05%偏重亚硫酸钠溶液，醋酸酐吡啶混合液，05%~1%淀粉糖化酶溶液。

5 材料

鼠肝、肾、心肌、骨骼肌或其他组织、大豆或小麦、绿豆、洋葱、大蒜、蚕豆的根、茎、叶等。

6 每个实验小组的用量 61 器材

切片机，切片刀，温台，恒温箱，熔蜡炉，水浴锅等这类几个小组用一台就行；解剖刀，单面刀片，小台木，毛笔一只，蜡铲一个，盖玻片和载玻片30个，脸盆一个，酒精灯各一个，包埋纸盒2~3个，染色缸一个，瓷杯3个，显微镜一台。

62 试剂

FAA固定液50ml、1%番红100ml、1%固绿100ml、1%过碘酸100ml、Schiff试剂100ml、亚硫酸盐300ml、醋酸酐吡啶混合液100ml、05%~1%淀粉糖化酶溶液200ml，石蜡半盒、蜂蜡10块、埃利希苏木精染液100ml、1%伊红酒精溶液100ml、1%盐酸酒精溶液100ml、95%酒精5瓶、二甲苯2瓶，甘油蛋白粘片剂数滴，中性树胶数滴。

63 材料

小白鼠一只、蚕豆种，小麦和大豆种10~20粒，洋葱和大蒜由实验室统一种，然后取其所需部分。

7 石蜡切片法实例（一）

—苏木精伊红对染法

71 目的要求

1、 熟悉石蜡切片的制作过程。

2、 掌握HE染色的基本原理和染色方法。

72 实验原理

石蜡切片是最基本的切片技术，冰冻切片和超薄切片等都是在石蜡切片基础上发展起来的。苏木素与伊红对比染色法（简称HE对染法）是组织切片最常用的染色方法。这种方法适用范围广泛，对组织细胞的各种成分都可着色，便于全面观察组织构造，而且适用于各种固定液固定的材料，染色后不易褪色可长期保存。经过HE染色，细胞核被苏木素染成蓝紫色，细胞质被伊红染色呈粉红色。

73 实验用品

（一） 器材

切片机，切片刀，温台，恒温箱，解剖刀，镊子，剪刀，解剖针，单面刀片，小台木，洒精灯，包埋纸盒，染色缸，烧杯，水盆，熔蜡炉，蜡杯。

（二） 试剂

卡诺（Carnoy）固定液，埃利希苏木精染液，1%伊红酒精溶液，1%盐酸乙醇液，各级酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，甘油蛋白粘片剂，中性树胶。

试剂配法：

1、卡诺氏固定液：

100%酒精3份

冰醋酸 1份

或：100%酒精6份

氯仿 3份

冰醋酸 1份

2、埃利希苏木精染液的配法：

苏木精 1g

纯酒精 50ml

冰醋酸 5 ml

甘油 50 ml

钾矾（硫酸铝钾）约5g（饱和量）

蒸馏水 50 ml

配法：

ⅰ、将苏木精溶于约15 ml的纯酒精中，再加冰醋酸后搅拌。

ⅱ、当苏木精溶解后即将甘油倒入并摇动容器，同时加入其余的酒精。

ⅲ、将钾矾在研钵中研碎并加热，然后将它溶解于水中。

ⅳ、将温热的钾矾溶液一滴一滴地加入上述染液中，并随时搅动。

ⅴ、此液混合完毕，将瓶口用一层纱布包著小块棉花塞起来，放在暗处通风的地方，并经常摇动以促进它的成熟。成熟时间约3~4周。若加入02g碘酸钠，可立刻成熟。此液稳定而染色均匀，染核效果良好，不会发生沉淀，长期贮备无妨。此液可分别与伊红等进行二重染色。

3、1%伊红酒精溶液：

伊红1g溶于100 ml95%酒精溶液。

4、1%盐酸乙醇液

盐酸 1份

70%酒精 100份

5、甘油蛋白贴片剂：

蛋白 50 ml

甘油 50 ml

水杨酸钠（防腐剂） 1g

配制时将鸡蛋一个打破入碗或杯中，去蛋黄留下蛋白，用玻棒调打成雪花状泡沫，然后用粗纸或双层纱布过滤到量筒中，经数小时或一夜，即可滤出透明蛋白液。此时在其中再加等量的甘油，稍稍振摇使两者混合。最后加入防腐剂（水杨酸钠）作防腐用。可保存几个月。

（三） 材料

鼠肝

74 实验程序

1、 取材

颈椎脱臼法处死小鼠，打开腹腔，剪取肝组织（或小肠）。切取的组织块不宜太大，以便固定剂穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm为宜。取下所需要的肝组织，切成一小块2~3mm厚。

取材的注意事项：

（1）取材动作要迅速，不宜作太久的拖延以免组织细胞的成分、结构等发生变化。

（2）切片材料应根据需要观察的部位进行选择，尽可能不要损伤所需要的部分。

2、固定

将切好的肝组织用生理盐水组织洗一下，立即投入卡诺固定液中固定，固定30~50min。

固定的注意事项：

（1）一般固定液，都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化，失去固定作用。

（2）有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定时就没有作用了。

（3）固定材料时，固定液必须充足，一般为材料块的20~30倍，有些水分多的材料，中间应更换1~2次新液。

（4）材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，并随同材料在溶液中投入相应的标签，以免相互混淆。标签上注明固定液、材料来源、日期等。标签上的文字，应用黑色铅笔或绘图黑墨水书写。

1、 洗涤

材料经固定后，除乙醇外，组织中的固定液必须冲洗干净，尤其是含有重金属的固定液。因为残留在组织中的固定液，有的不利于染色，有的产生沉淀或结晶影响观察。冲洗方法根据固定液的性质而定，固定液为水溶液的常用水洗涤，固定液含有乙醇的则用50%~70%乙醇冲洗。

2、 脱水

30%、50%、70%、80%、90%各级乙醇溶液脱水各40min，放入95%、100%各两面三刀次，每次20min。各种材料经固定与洗涤后，组织中含有大量水分，由于水与石蜡不能互溶，所以必须将组织中的水分除去。

脱水注意事项

（1）脱水必须在有盖的玻璃品中进行，防止吸收空气中的水分。

（2）在更换高一级的脱水剂时，最好不要移动材料以免损坏，可用吸管吸出器皿中的脱水剂，再用吸水吸尽器皿内剩余液，然后于皿中加入高一级脱水剂。

（3）在低浓度或纯酒精中，每级停留不宜太长，否则易使组织变软，助长材料的解体。

（4）在高浓度或纯酒精中，每级停留的时间也不宜太长，否则会使组织变脆，影响切片。

（5）如需过夜，应停留在70%酒精中。

（6）脱水必须彻底，否则不易透明，甚至使透明剂内出现白色混浊现象

5、透明

纯酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯05h（或至透明为止），须换一次二甲苯。

由于乙醇与石蜡不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蜡，所以脱水后还要经过二甲苯以过渡。当组织中全部被二甲苯占有时，光线可以透过，组织呈现出不同程度的透明状态。

透明注意事项

（1）使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中的水分进入。

（2）更换每级透明剂，动作要迅速，一方面为了不使材料块干涸，另一方面能避免吸收湿气。

（3）在透明过程中， 如果材料周围出现白色雾状，说明材料中的水未被脱净，应退回纯酒精中重新脱水，然后再透明。

6、透蜡

放入二甲苯和石蜡各半的混合液15min，再放入石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ透蜡各20~30分钟。

透蜡的目的是除去组织中的透明剂（如二甲苯等），使石蜡渗透到组织内部达到饱和程度以

便包埋。透蜡时间根据组织的透蜡时间较长，约需1~2d。透蜡应在恒温箱内进行，并保持箱内温度在55~60℃左右，注意温度不要过高，以免组织发脆。置于恒温箱05h。

透蜡注意事项

（1）尽量保持在较低温度中进行，以石蜡不凝固为度；

（2）透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；

（3） *** 作要迅速，力求在最短的时间内完成石蜡透入过程，以免引起组织变硬、变脆、收缩等。

1、 包埋

将经过透蜡的组织连同熔化的石蜡，一起倒入容器内，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蜡块。

用于包埋的石蜡的熔点在50~60℃之间，包埋时应根据组织材料、切片厚度、气候条件等因素，选择不同熔点的石蜡。一般动物材料常用的石蜡熔点为52~56℃，植物材料用的石蜡熔点为54~58℃。

包埋的 *** 作过程

包埋时，将纸盒放在已经加热的温台上，从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯3，迅速轻轻地用镊子夹取材料平放于纸盒底部（注意切面朝下放置），再用温镊子轻轻拨动材料，使之排列整齐。轻轻将纸盒两侧的把手提起，慢慢地平放在面盆，并立即使它沉入水中，使盒中包埋块迅速凝固。待石蜡完全凝固（约30min）后即可取出备用。

2、 切片

①将已固定和修好的石蜡块台木装在切片机的夹物台上。

②将切片刀固定在刀夹上，刀口向上。

③摇动推动螺旋，使石蜡块与刀口贴近，但不可超过刀口。

④调整石蜡块与刀口之间的角度与位置，刀片与石蜡切片约成15度左右。

⑤调整厚度调节器到所需的切片厚度，一般为4~10微米。

⑥一切调整好后主可以开始切片。此时右手摇动转轮，让蜡块切成蜡带，左手持毛笔将蜡带提起，摇转速度不可太急，通常以40~50r/min。

⑦切成的蜡带到20~30cm长时，右手用另一支毛笔轻轻将蜡带挑起，以免卷曲，并牵引成带，平放在蜡带盒上，靠刀面的一面较光滑，朝下，较皱的一面朝上。

⑧用单面刀片切取蜡片一小段，放在载玻上加水一滴，置于放大镜或显微镜下观察切片是否良好。

⑨切片工作结束后，应将切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蜡，把切片机擦拭干净妥为保存。

3、 贴片

①、取一片清洁的载玻片，滴一滴粘片剂于玻片中央，然后用洗净的手指加以涂抹，便成

均匀薄层。

②、滴1~2滴的蒸馏水已涂粘片剂的载玻片上。

③、用小镊子夹取预先用刀片割开的蜡带，放在水面上，注意蜡片光亮平整的一面贴于玻片上，并使之处于稍偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签。

④、把玻片摆好片位置，在酒精灯火焰上方适度加热至蜡片舒展。或放置置于预先加热的展片台上（温度保持在40~45℃）。此时蜡片因受热而伸展摊平。并使之处于稍偏玻片的一端，另一端便于粘贴标签。

⑤、展片后把载玻片放在平盘上编好记号置于37℃温箱烘干，一昼夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。

10、脱蜡复水

石蜡切片经二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各5~10min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各级酒精溶液中各3~5min，再放入蒸馏水中3min。

染色液多数为水溶液，因此，染色前必须将蜡脱去，使切片中的材料由有机相进入到水相。一般采用二甲苯脱蜡，逐级复水与脱水浸蜡过程正好相反，但是，由于蜡片较薄，所需时间比脱水浸蜡要短的多。

11、染色

切片放入苏木精中染色约10~30min。染色时间应根据染色剂的成熟程度及室温高低，适当缩短或延长。室温高时促进染色，染色时间可短些，否则可适当延长时间，冬季室温低时可放入恒温箱中染色。

12、水洗

用自来水流水冲洗约15min。冲洗过程中使切片颜色发蓝（或放入堿性水中也可，但用促蓝剂对伊红可能拒染，如果时间来得及，应以流水冲洗使切片显示蓝色为宜），但要注意流水不能过大，以防切片脱落，并随时用显微镜检查见颜色变蓝为止。

13、分化

就是将细胞质著的色褪去，使细胞核着色更加鲜明，也称分色。将切片放入1%盐酸乙醇液（盐酸1份+70%乙醇100份）中褪色，见切片变红，颜色较浅即可，约数秒至数十秒钟。这一步骤是HE染色成败的关键，，如分化不当会导致染色不匀，或深或浅，得到的切片染色效果差。如果染色适中，可取消此步骤。

14、漂洗

切片再放入自来水流水中使其恢复蓝色。低倍镜检查见细胞核呈蓝色、结构清楚；细胞质或结缔组织纤维成分无色为标准。然后放入蒸馏水中漂洗一次。

15、脱水Ⅰ

切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3~5min。

16、复染

用05%伊红乙醇液对比染色2~5min。伊红主要染细胞质，着色浓淡应与苏木精染细胞

核的浓淡相配合，如果细胞核染色较浓，细胞质也应浓染，以获得鲜明的对比。反之，如果细胞核染色较浅，细胞质也应淡染。可在伊红乙醇液中滴加数滴冰醋酸助染，促使细胞质容易着色，并且经乙醇脱水时不易褪色。

17、脱水Ⅱ

放入95%乙醇中洗去多余的红色，然后放入无水乙醇中3~5min。最后用吸水纸吸干多余的乙醇。

18、透明

切片放入二甲苯乙醇等量混合液中约5min，然后放入纯二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5min。二甲苯应尽量保持无水，应经常更换，或用纱布包无水硫酸铜放入染色缸内吸收水分。切片如在二甲苯中出现白雾现象，说明脱水未尽，应退回乙醇中重新脱水，否则切片难以镜检。

19、封藏：中性树胶封存

切片经染色、脱水、透明后，即可用封藏剂将其封藏起来，目的是永久保存切片，便于镜检。常用的封藏剂一类为干性封藏剂如中性树胶、加拿大树胶等，另一类为湿性封藏剂如甘油明胶等。如果切片是经二甲苯透明，则用树胶作为封藏剂，树胶可以用二甲苯稀释至合适的稠度。如果切片是直接从水中或水溶液中取出，则常用甘油明胶作为封藏剂，可用于短期保存标本。

封藏的方法：

封片前应根据材料的大小，选用不同规格的盖玻片。材料透明后，按照下列方法进行封藏。在桌上放一张洁净的吸水纸，将含材料的载玻片从二甲苯中取出放在纸上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴树胶（千万不能待二甲苯干燥后再进行），用右手持小镊子轻轻地夹住盖玻片的右侧，稍为倾斜使其左侧与封藏剂接角，然后再缓慢地将盖玻片放下，这样就可以减少或避免产生气泡。如胶液不足，可以用玻棒再滴一滴树胶从盖玻片边缘补足。如胶液过多，可在干燥以后用刀刮去，并用纱布蘸二甲苯拭去残留的树胶。

染色结果：细胞核被苏木素染成蓝色，细胞质被伊红染色呈粉红色。

8 石蜡切片法实例（二）

——番红固绿对染法

81 目的要求

1、 熟悉植物石蜡切片的制作过程。

2、 掌握番红固绿对染法的基本原理和具体方法。

82 实验原理

石蜡切片法也是在研究植物细胞的形态结构等方面常用的制片方法。它可以使植物材料切成薄的薄片，又可以切成连续薄片，切片经染色，观察效果甚好。番红固绿对染法，为

植物制片上最普遍的一种二重染色法，其染色程序简单并能清晰地显示出细胞的结构。番红为堿性染料，能使细胞核及木质化的细胞壁染成红色；固绿为酸性染料，能使细胞质及纤维素的细胞壁染成绿色。

83 实验用品

（一） 器材

切片刀，切片机，温箱，温台，解剖刀，镊子，单面刀片，台木，毛笔，蜡铲，酒精灯，包埋纸盒，染色缸，玻片盘，温度计，脸盆。

（二）试剂

FAA固定液，1%番红，1%固绿，各级酒精（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，石蜡，郝普特氏明胶粘片剂，树胶。

试剂配法：

1、FAA固定液（福尔马林醋酸洒精混合液）

福尔马林 5 ml

50%或70%的洒 90 ml

冰醋酸 5 ml

此液适用于植物组织，此液中的酒精，有用50%的，也有用70%的，一般薄嫩的材料右用50%的，厚硬的材料用70%的，醋酸的用量也可根据材料情况作适当的改变，对一些大块而密实的组织可增加用量，同时减少福尔马林的用量。固定时间可因材料及醋酸含量的变化而异，一般为5~20h。固定的材料，一般无需用水洗，可直接从70%的酒精开始脱水。

1、 1%番红

番红1g溶于100ml水中。

2、 1%固绿

1g固绿溶于100ml95%酒精中。

3、 郝普特氏明胶粘片剂

明胶 1g

蒸馏水 100ml

石炭酸 2g

甘油 15ml

配制时先将明胶溶解于30℃的蒸馏水中（在水浴锅内进行），待溶解后再加石炭酸和甘油，搅拌均匀后，趁热过滤，贮存于玻璃瓶中。

（三）材料

大豆、小麦、绿豆、洋葱、大蒜、蚕豆等。

84 实验程序

1、 取材

取已培养好的大豆、小麦、蚕豆根或茎、叶等用刀片将其尖端约12cm根尖切割下来，用刀

片切割其成熟区部分成5mm长的小段（亦可切带侧根的部分），将切好的材料放入玻管中。

2、 固定

将FAA固定液倒入盛有材料的玻管中，固定时间为24h。

3、 冲洗

用70%酒精换洗3次，每次052h。

4、 脱水

80%、90%酒精各12h，纯酒精（中间换一次）12h。

5、 透明

等量纯酒精及二甲苯中12h，二甲苯（中间换一次）12h。

6、 透蜡

方法同前。

7、 包埋

方法同前。

8、 切片

根为横切面，其厚度为8~10um。

9、 贴片。

方法同前。

10、 番红固绿对染法染色程序如下：

（1）切片在二甲苯中脱蜡，约10min。

（2）等量纯酒精二甲苯5min。

（3）经纯酒精，95%、90%、80%、70%、505、305各级酒精各5min。

（4）蒸馏水25min。

（5）1%番红水溶液染色2h左右。

（6）用水洗去多余染液。

（7）50%、70%、80%、90%、95%各级酒精脱水10min。

（8）1%的固绿（用95%酒精配制）染色1040s。

（9）95%酒精洗一下。

（10）纯酒精脱水5min。

（11）等量纯酒精二甲苯混合液中5min。

（12）二甲苯5min。

（13）中性树胶封藏。

注意：

（1）番红与固绿在酒精中很容易脱色，因此在酒精中脱水时，不能放置太久。

（2）用固绿对染之前应检查番红染色的是否合适，所染颜色应稍深一些，以防其在以后脱水步骤中仍会脱色，如果太浅，应退回重染。

分析方法实际上是在某一特定的气相色谱分析中使用的一系列条件。建立分析方法实际上是确定对于某一分析的最佳条件的过程。

为了满足某一特定的分析的要求，可以改变的条件包括进样口温度，检测器温度，色谱柱温度及其控温程序，载气种类及载气流速，固定相，柱径，柱长，进样口类型及进样口流速，样品量，进样方式等。检测器还可能有其它可供调节的参数，这取决于所使用的检测器类型。有一些气相色谱仪还有可以控制样品与载气流向的阀门，这些阀门开启与关闭的时间也可能对分析的效果有重要影响。

右图为GeoStrata Technologies生产的Eclipse气相色谱仪。它以三分钟为周期持续运转。该仪器有两个阀门，用来控制载气进入定量管。当定量管充满样品气后，切换阀门，载气就会通过定量管。载气的压强会将样品带入到色谱柱中进行分离。 典型的载气包括氦气、氮气、氩气、氢气和空气。通常，选用何种载气取决于检测器的类型。例如，放电离子化检测器（DID）需要氦气作为载气。不过，当对气体样品进行分析的时候，载气有时是根据样品的母体选择的，例如，当对氩气中的混合物进行分析时，最好用氩气作载气，因为这样做可以避免色谱图中出现氩的峰。安全性与可获得性也会影响载气的选择，比如说，氢气可燃，而高纯度的氦气某些地区难以获得。（参见：氦气——分布与生产）

很多时候，检测器不仅仅决定了载气的种类，还决定了载气的纯度（虽然对灵敏度的要求也在很大程度上影响载气纯度的要求）。通常来说，气相色谱中所用的载气，纯度应该在99995%以上。用于标识纯度的典型商品名包括“零点气级”，“高纯度（UHP）级”，“45级”和“50级”。

载气流速对分析的影响在方式上与温度类似（见下文）。载气流速越高，分析速度越快，但是分离度越差。因此，最佳载气流速的选择与柱温的选择一样，都需要在分析速度与分离度之间取得平衡。

二十世纪九十年代之前生产的气相色谱仪的载气流速往往通过载气入口的压力（柱前压）进行控制，实际的载气流速则在柱的出口端通过电子流量计或皂膜流量计进行测定。这样的一个过程常常很复杂，很耗时间，而且往往令人沮丧。在整个运行过程中，柱前压不能再改变，气流必须稳定。气体流速与柱前压的关系可以通过可压缩流体的Poiseuille方程来计算。

不过，很多现代的气相色谱仪已经能用电路自动测定气体流速，并通过自动控制柱前压来控制流速。因此，载气压强与流速可以在运行过程中调整。柱前压/气流控制程序（与温度控制程序类似）随之出现。 进样技术

气相色谱中的十分之一原则

真正的气相色谱分析过程从样品进入色谱柱开始。毛细管气相色谱法的发展使得进样技术面临着很多实践中的问题。柱上进样技术多用于填充柱而不适用于毛细管柱。在毛细管气相色谱仪中的进样技术应该满足以下两个条件：

进样量不得超过柱的容量；

与展开过程引起的样品展宽相比，进样后的塞式流宽度应该很小。如果不能满足这一要求，色谱柱的分离能力将会下降。一个普遍的规则是，注入的体积，Vinj，和检测器的体积，Vdet，应该只有样品中包含被分析物的部分出柱时的体积的十分之一。

以下是一些优秀进样技术应当满足的一般要求：

应该能使色谱柱达到它的最佳分离效率；

对于小量的有代表性的（典型）样品，进样应具有准确性和可重现性；

不能改变样品组成（对于具有不同的沸点、极性、浓度与热力学稳定性的物质，进样过程中不应有所差异）；

应该既适用于痕量分析，也适用于浓度相对较大的样品。 柱温与温度控制程序

一个已经拆开以显示出内部毛细管柱的气相色谱仪恒温箱

气相色谱仪中的色谱柱放置于温度由电子电路精确控制的恒温箱内。（当分析者说“柱温”时，他实际上指的是恒温箱的温度。不过这种区别并不重要，因此在下文中对这两者并不作区分。）

样品通过色谱柱的速率与温度正相关。柱温越高，样品越快通过色谱柱。但是，样品越快通过色谱柱，它与固定相之间的相互作用就越少，因此分离效果越差。

通常来说，柱温的选择是综合考虑分离时间与分离度的结果。

柱温在整个分析过程中不变的方法称为恒温方法。不过，在大部分的分析方法中，柱温随着分析过程的进行逐渐上升。初温，升温速率（温度“斜率”）与末温统称为控温程序。

控温程序使得较早被洗脱的被分析物能够得到充分的分离，同时又缩短了较晚被洗脱的被分析物通过色谱柱的时间。

咸水鸭

原料：鸭腿、盐、花椒、葱段、姜片、八角、香叶和少许料酒。

做法：

1、将买回来的鸭腿洗干净放在漏碗里控水；

2、根据各人喜好控制盐和花椒的多少，盐和花椒的比例是二比一，放在铁锅里用中火翻炒；

3、等盐微黄、花椒变黑关火

4、将热盐均匀地撒在鸭肉内外用手搓，多搓几遍，然后用保鲜袋把鸭肉裹紧包好放入恒温箱

5、腌六个小时取出，再挂在阴凉通风处风干六个小时，腌制过程就结束了

6、将洗干净的鸭腿摆放在锅里加水，水刚刚没过鸭肉，加葱段、姜片、八角、香叶和少许料酒

7、煮好放入恒温箱，凉透后改刀装盘浇上汤就可以

重点注意腌制环节

在自然界里，食用菌都不是单独存在的，而是和许多细菌、放射菌、霉菌等生活在一起的。所谓菌种分离，就是把这些和食用菌一起生活的杂菌分离出来，通过培养，获得纯的优良菌种。菌种分母种、原种、栽培种。

(一）母种的分离培养

食用菌母种的分离，可分为孢子分离法、组织分离法以及基内菌丝分离等。

1孢子分离法

孢子分离法，是用食用菌的有性孢子或无性孢子萌发成菌丝，培养成菌种的方法。这种菌种生活力较强，但孢子个体之间有差异，且自然分化现象较严重，变异大，需经出菇试验才能在生产上应用。

（l）单孢分离法：是每次或每支试管只取一个担孢子， 让它萌发成菌丝体来获得纯菌种的方法。蘑菇和草菇用单孢分离得到的菌丝，有结实能力，可采用此法分离生产纯菌种。单孢分离生产上较少采用，而且技术复杂，一般采用多孢分离法。

（2）多孢分离法：就是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法。具体 *** 作方法，有以下几种：

①种菇孢子d射法：选择个体健壮、朵形圆正，无病虫害、出菇均匀、高产稳产，适应性强的八九分成熟的种菇，切去大部分，菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分。在接种箱或无菌室内，把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面，漏斗倒盖在培养皿上面；上端小孔用棉花塞住。培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上，静置12～20小时，菌褶上的孢子就会散落在培养皿内。形成一层粉末状孢子印（平菇极淡紫色，蘑菇、草菇 为褐色，香菇、金针菇孢子印白色）。用接种针沾取少量孢子在试管中的琼脂外面或培养皿上划线接种。待孢子萌发，生成菌落时，选孢子萌发早、长势好的菌落进行试管培养。

还可用孢子采集器收集孢子。方法是选好种菇后，按上述程序，轻轻掀开玻璃钟罩，将种菇柄朝下插在孢子采收器的钢丝架上，放在培养皿正中央。随即盖好玻璃罩，用纱布将钟掌周围塞好。并在纱布上倒少许升汞或无菌水。移入 20℃左右恒温箱培养。

②褶上涂抹法：按无菌 *** 作分离时；应选择成熟的种菇，用接种针直接插入褶片之间，轻轻抹取褶片表面子实体尚未d射的孢子，再在培养基上划线接种。

③钩悬法：取成熟菌盖的几片菌褶或一小块耳片（黑木耳、毛木耳、白木耳〕，用无菌不锈钢丝（或铁丝、棉线等其他悬挂材料）悬挂于三角瓶内的培养基的上方，勿使接触到培养基或四周瓶壁。置适宜温度下培养、转接即可。

④贴附法：按无菌 *** 作将成熟的菌褶或耳片取一小块， 用溶化的琼脂培养基或阿拉伯胶、浆糊等贴附在配管斜面培养基正上方的试管壁上。经6～12小时的培养，待孢子落在斜面上，立即把孢子连同部分琼脂培养基移植到新的试管中培养即可。

孢子分离得到的母种、必须进一步提纯复壮，当母种定植一星期左右，菌丝布满斜面时，选择菌丝健壮、生长旺盛无老化、无感染杂茵的母种试管，进而转管扩大，一般到栽培种，转管不宜超过5次。

孢子分离得到的母种，必须通过出菇试验，鉴定为优质菌种后，才可供生产使用。

一般菌类如蘑菇、平菇、凤尾菇、香菇、冬菇和草菇等，都可用多孢分离法获得母种。

以上就是关于脉动真空压力蒸汽灭菌器为什么第三方检测全部的内容，包括:脉动真空压力蒸汽灭菌器为什么第三方检测、蘑菇菌种是怎么培养的、叙述结核杆菌的检验程序等相关内容解答，如果想了解更多相关内容，可以关注我们，你们的支持是我们更新的动力！